Репетиторские услуги и помощь студентам!
Помощь в написании студенческих учебных работ любого уровня сложности

Тема: Процесс получения зернового сусла и других составляющих для производства спирта

Вид работы:

Дипломная (ВКР) по теме: Процесс получения зернового сусла и других составляющих для производства спирта
Предмет:

Другое
Когда добавили:

22.03.2012 11:29:29
Тип файлов:

MS WORD
Проверка на вирусы:

Проверено - Антивирус Касперского

Другие экслюзивные материалы по теме

Полный текст:

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

1. Объекты и методы исследований

2. Анализ и биохимическая характеристика ферментных
препаратов

3. Анализ промышленных и новых отселекционированных
рас спиртовых дрожжей

4. Испытания биотехнологии интенсивного сбраживания зернового сусла с применением комплексных ферментных препаратов и новых рас дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами в производственных условиях спиртовых заводов

Выводы

Литература

Приложения

Введение

Как и все отрасли пищевой промышленности, спиртовая отрасль испытывает в настоящее время большие трудности, приводящие к снижению объемов производства продукции, повышению ее себестоимости из-за диспропорции в ценовой политике (рост цен на сырье и электроэнергию намного опережает рост цен на продукцию), трудностей со сбытом продукции, нестабильности работы предприятии.

Производственная база спиртовой отрасли насчитывает более 200 заводов, как больших, так и мелких предприятий, обладающих достаточным потенциалом для полного удовлетворения потребностей в пищевом спирте высокого качества. На действующем оборудовании спиртзаводов объем стабильного производства спирта можно довести до 200 млн.дал в год без введения в действие дополнительных мощностей. Однако, за последние 10 лет вследствие сокращения объемов выпуска алкогольной продукции, низкой рентабельности производства значительно понизился уровень технической оснащенности предприятий. Износ основного технологического оборудования большинства спиртзаводов достиг 50% (1).

Поэтому необходимо дальнейшее совершенствование технологических процессов, создание новых ресурсосберегающих технологий и оборудования с целью интенсификации спиртового брожения, снижения себестоимости получаемой продукции, сокращения расхода теплоэнергетических ресурсов, максимального использования существующих мощностей спиртового производства, повышения качества и конкурентоспособности продукции на отечественном и мировом рынке (2).

Повышение рентабельности пищевых производств возможно при использовании высокоактивных биологических катализаторов различного спектра действия, технологии применения которых в спиртовом производстве разработаны в нашем институте. Их внедрение на заводах России позволило быстрыми темпами вытеснить солод; высвободить из производства более 200 тысяч тонн высококачественного пищевого зерна; внедрить на 30 заводах отрасли прогрессивные ресурсосберегающие технологии гидродинамической и ферментативной обработки крахмала сырья, что с солодом было практически невозможно.

За последние годы значительно изменился состав зернового сырья перерабатываемого на спирт. Наиболее широко распространенными культурами стали рожь, ячмень и зерносмеси с превалирующим количеством в них этих культур. Переработку пшеницы на спирт проводили в ограниченных количествах и преимущественно в южных регионах. Кроме того, изменился и углеводный состав перерабатываемых зерновых культур за счет увеличения в нем доли некрахмалистых полисахаридов. Дефицит зерна, который имел место последние годы, привел к значительному повышению цен на зерно, что негативно сказалось на конкурентоспособности спирта (по цене) по сравнению с импортируемым из-за рубежа. Наиболее актуальным и перспективным направлением в совершенствовании технологии спирта становится эффективное использование всех высокомолекулярных полимеров зернового сырья с целью его экономии и повышения выхода конечного продукта — спирта. Применение новых ферментных препаратов позволит более рационально использовать компоненты зернового сырья.

Анализ патентной и специальной литературы, а также опыта отечественной и зарубежной науки и практики показал, что для повышения эффективности биоконверсии трудносбраживаемых видов сырья, таких как рожь и ячмень, необходимо введение в состав ферментного комплекса наряду с традиционно используемыми амилазами бета-глюканаз, ксиланаз, ферментов целлюлолитического и цитолитического действия. С целью повышения бродильной активности дрожжей, улучшения технологических показателей сусла, ускорения процессов дрожжегенерации и брожения — применение комплекса кислых и слабокислых протеаз (3-5).

Разрабатываемые научные основы новой технологии будут учитывать состав белковых веществ и некрахмальных соединении различных видов зернового сырья, для повышения эффективности биоконверсии которых планируется применение специально подобранных мультиэнзимных композиций цнлевого назначения. Их использование позволит интенсифицировать процесс спиртового брожения и увеличить выход спирта.

Узким местом на спиртовых заводах остается бродильное отделение. Увеличение производительности бродильного отделения путем установки дополнительных бродильных емкостей требует больших капитальных затрат. Повысить эффективность работы бродильного отделения можно как за счет расширения ассортимента используемых ферментов, так и за счет улучшения качества спиртовых дрожжей. Традиционно в спиртовой промышленности применяли одну расу дрожжей, обеспечивающую достаточную скорость брожения и устойчивый выход спирта. Новые направления развития технологии производства спирта ставят такие задачи, как повышение концентрации перерабатываемого сусла, проведение брожения при повышенных температурах и повышенной крепости в бражке, обеспечение дальнейшего сокращения себестоимости спирта за счет экономии сырья, топлива и электроэнергии. В таких условиях нужны расы дрожжей, обладающие осмофильностью, термостабильностью и высокой бродильной активностью. Поэтому селекционные работы по скринингу активных рас дрожжей являются также перспективным направлением совершенствования технологии производства спирта. В настоящее время получены новые высокопродуктивные расы дрожжей, обладающие осмофильностью и термотолерантностью. Эти расы способны сбраживать сусло с концентрацией сухих веществ более 20%, они устойчивы к повышенным температурам брожения и повышенным концентрациям спирта. Внедрение термотолерантных и осмофильных рас дрожжей позволит ускорить процесс брожения, увеличить выход спирта, повысить его качество и снизить потери сырья.

В связи со сложившейся большой конкуренцией на рынке алкогольной продукции получение высококачественного спирта является важной задачей.
Известно, что существенное влияние на формирование вкуса и аромата
спирта оказывают летучие примеси, образующиеся в процессе брожения и
не удаленные при ректификации (6). Основными факторами, оказывающими негативное воздействие на органолептические показатели пищевого спирта, являются плохое качество зернового сырья и воды, высокие температурные
режимы при водно-тепловой обработке зерна, экстремальные для дрожжей технологические параметры брожения (повышенная температура и
концентрация сухих веществ сусла, увеличенные сроки брожения),
недостаточное соблюдение микробиологической чистоты процесса. При
этом наиболее существенное влияние оказывает качество
перерабатываемого сырья. Сорность зерна, содержание токсичных примесей, зараженность вредителями хлебных злаков, излишняя влажность,
инфицирование зерна фитопатогенной микрофлорой и эпифитными
микроорганизмами (плесневыми грибами, дикими дрожжами и бактериями)
все это приводит к повышению образования побочных метаболитов,
придающих спирту излишнюю горечь, жесткость и резкость, не характерный
спирту запах.

Кроме того, как на образование летучих примесей, их количество и состав, оказывает также влияние раса используемых дрожжей. Поэтому проведение исследований по применению спиртовых дрожжей нового поколения даст возможность не только интенсифицировать процесс брожения, но и повысить качество спирта.

Внедрение результатов научно-исследовательских работ позволит повысить эффективность спиртового производства, ускорить процесс биоконверсии зернового сырья, уменьшить расход электроэнергии, увеличить выход спирта, повысить качество конечного продукта, что обеспечит снижение себестоимости спирта, повышение его конкурентоспособности.

Таким образом, анализ современного состояния производства в спиртовой отрасли, проведенный с учетом результатов экспериментальных исследований, достижений зарубежной и отечественной науки и практики позволили определить основные задачи для создания интенсивной технологии получения спирта на основе комплексного использования мультиэнзимных систем целевого назначения и новых рас спиртовых дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами. Для их реализации необходимо:

- провести анализ и исследовать биохимическую характеристику ферментных препаратов различного спектра действия для разжижения и осахаривания крахмала сырья, протеолиза белковых веществ и гидролиза некрахмальных полисахаридов зернового сырья;

- провести анализ промышленных и новых отселекционированных рас спиртовых дрожжей;

- исследовать уровень бродильной активности отобранных рас дрожжей;

- осуществить скрининг дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами;

- изучить влияние температуры, концентрации сухих веществ зернового сусла и спирта на жизнедеятельность дрожжей;

- провести производственные испытания по применению новых рас

дрожжей для интенсификации процессов дрожжегенерации и спиртового брожения;

- разработать Технологическую инструкцию по применению термотолерантной и осмофильной расы дрожжей в спиртовом производстве.

Объекты исследований

Объектами исследований на разных этапах работы являлись ферментные препараты протеолитического, амилолитического и целлюлолитического действия различного микробного происхождения. Всего исследовано 18 образцов.

Объектами исследования служили культуры плесневых грибов — продуценты кислых и слабокислых протеаз, и бактерий - продуцентов амилолитических ферментов, имеющиеся????(ихся) в музее чистых культур и отселекционированные???(ых) в отделе биотехнологии ферментных препаратов ВНИИПБТ.

Объектами исследований служили различные расы спиртовых дрожжей, выделенные из промышленных культур, а также полученные селекционным путем и из музея чистых культур.

Продуценты культивировали глубинным способом на натуральных средах, в состав которых входили различные виды муки и минеральные соли. Количество и состав компонентов зависел от условий экспериментов.

Культивирование продуцентов проводили в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с 50 мл среды; в полупроизводственных условиях - в ферментаторах объемом 15 дм³ «Биоинжениринг» при степени заполнения 0,5; в производственных условиях - в ферментаторах объемом 20 и 32 м³ с коэффициентами заполнения 0,5 и 0,7 в течение 42 - 72 часов.

Методы исследований

В работе применены общепринятые и специальные физические, физико-химические, химические, биохимические, микробиологические, хроматографические, газовые и жидкостные, и спектрофотометрические методы анализа.

Важной характеристикой любой ферментной системы является уровень активности отдельных ферментов комплекса.

В настоящем исследовании проводилось определение различных ферментативных активностей, позволяющих составить представление о качественном и количественном составе того или иного комплекса, а также направленности его действия.

Амилолитическая активность

Амилолитическую активность определяли общепринятым методом гидролиза крахмала по ГОСТу РФ 20264.4-89 (7).

Общая протеолитическая активность

Протеолитическая активность характеризует способность фермента катализировать расщепление белков до аминокислот или пептидов. Протеолитическую активность (ПС) определяли модифицированным методом Ансона по гидролизу гемоглобина препаратам фермента с последующей его инактивацией и осаждением непрогидролизованного белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ). За единицу активности принимали такое количество фермента, которое за 1 мин при 20°С способствовало образованию 1 мкм тирозина при гидролизе белка (8).

Активность индивидуальных протеолитических ферментов

Активности сериновой, карбоисильной и металлопротеиназ, лейцинамино- и карбоксипептидаз измеряли по специфическим субстратам. Для обнаружения возможного вклада в гидролиз субстратов других протеаз комплекса применяли специфические ингибиторы. За единицу активности во всех случаях принимали такое количество фермента, которое в стандартных условиях за 1 мин. расщепляло 1 мкм субстрата.

Активность сериновой протеиназы определяли по специфическому субстрату n-нитроанилид бензол-оксикарбонил-L-аланил-K-аланил-L-лей-цину (Z-Ala-Ala-Leu-pNa, завод химреактивов "Олайне"). При определении вклада в гидролиз субстрата других протеолитических ферментов комплекса применяли специфический ингибитор сериновой протеиназы фенилметилсульфонилфторид (PMSF, фирмы "Serva", ФРГ).

Об активности нейтральной металлопротеиназы судили по гидролизу специфического субстрата динитротрофенил-L-глицил-L-глицил-L-изолей-цил-L-аргинина (DNP-Gly-Gly-Ile-Arg), синтезирован Л.А. Люблинской). Активность металлопротеиназы подавляли атилендиаминтетраацетатом (ЭдтА).

Наличие активности карбоксильной протеиназы подтверждали с помощью специфического ингибитора пепсина N-диазоацетил-N'-2,4-динитрофенил-этилендиамина (ДДЭ, синтезирован Т.И. Вагановой). Активность нейтральной протеиназы, которая также могла гидролизовать субстрат подавляли CuCl . Остаточную активность определяли по методу Ансона с гемоглобином.

N-нитроанилид-L-лейцин служил специфическим субстратом при определении активности лейцинаминопептидазы.

Активность карбоксипептидазы определяли по специфическому субстрату динитрофенил-Lглицил-L-глицил-L-аргинину (DNP-Gly-Gly-Arg).

Экзо-b-глюканазная активность

Метод основан на определении восстанавливающих сахаров, образующихся при действии фермента на зерновой b-глюкан.

Ксиланазная активность

Определение ксиланазной активности основано на способности фермента расщеплять ксилан с образованием восстанавливающих сахаров.

Целлюлазная активность

Активность комплекса целлюлаз определялась по гидролизу фильтровальной бумаги (АФБ), КМЦ и целлюлозы.

Влияние температуры и рН на общую протеолитическую активность ферментного препарата определяли по результатам его воздействия на 2%-ный раствор гемоглобина при различных температурах и рН.

Аналогично определяли оптимум рН и температуры действия a-амилазы. В качестве субстрата использовали 1%-ный раствор крахмала.

Исследования по содержанию аминокислот, образующихся в результате ферментолиза зернового и картофельного сырья, проводили на ячменном и картофельном сусле и ячменной болтушке. Концентрацию общих и свободных аминокислот определяли по методу Мура и Штейна (9) на аминокислотном анализаторе LG 200 фирмы «Biotronik» (Германия); просчет аминограмм осуществляли методом сравнения площадей стандарта и образца.

Исследования по разжижению, осахариванию и сбраживанию зернового сырья проводили по методу постановки бродильных проб. В качестве субстрата использовали пшеницу, ячмень и рожь - как наиболее широко применяемые в спиртовой промышленности. Был исследован качественный состав используемого в экспериментальной работе сырья, содержание в нем основных высокомолекулярных полимеров (10).

Модельные опыты проводили по аналогии с технологическими схемами подготовки сырья с развариванием под давлением и по схеме механико-ферментативной обработки, где ведут гидродинамический и ферментативный гидролиз водно-мучной суспензии при температурах до 100°С. Для приготовления сусла использовали 20%-ные по сухой массе растворы измельченных ячменя, пшеницы и картофеля, предварительно обработанные при 125°С в течение 1,5 часа (как принято в спиртовом производстве). Ячменную болтушку готовили без предварительной термообработки.

Исследовали влияние ферментных препаратов различного спектра

действия, используемых при ферментативном гидролизе высокомолекулярных полимеров зернового сырья, на эффективность сбраживания зернового сусла и состав образуемых побочных продуктов брожения. Состав летучих примесей определяли газохроматографическим методом на газовом хроматографе HP «Agilent» 6850 (11-12).

В спиртовой промышленности, перерабатывающей крахмалистое сырье, широко применяются ферменты гидролитического расщепления крахмала. Для этой цели используют зерновой солод и ферментные препараты микробного происхождения. Применяемый в спиртовом производстве зерновой солод осуществляет гидролиз крахмала до сбраживаемых углеводов, является источником азотистого питания дрожжей и при осахаривании крахмалистого сырья производит частичную деструкцию его клеточных стенок и белковых веществ.

Однако, при применении солода, из-за ограниченной возможности создания достаточно высокой концентрации ферментов, скорость осахаривания и протеолиза сырья остается низкой, что затрудняет интенсификацию процесса брожения. Эффективная замена солода ферментами микробного происхождения является важной задачей. Опытом работы спиртовых заводов в последние 20 лет показано, что применение ферментных препаратов экономически оправдано: интенсифицируется процесс осахаривания крахмала, повышается степень использования сырья, стабилизируются технологические процессы.

Мировой опыт свидетельствует о возрастающих масштабах получения и применения ферментных препаратов как в объемах промышленной продукции (в среднем на 10-12%), так и в развитии научных разработок, направленных на повышение активности продуцентов, полученных с использованием генной инженерии, на применение термофильных микроорганизмов, на создание мультиэнзимных композиций и иммобилизованных ферментов.

В настоящее время спиртовая промышленность располагает широким ассортиментом концентрированных ферментных препаратов и новых рас спиртовых дрожжей, технологически устойчивых к повышенным температурам, концентрациям спирта, обладающих осмофильными свойствами. Использование новых рас дрожжей и оптимальных ферментативных систем позволит создать конкурентоспособную технологию производства спирта, обеспечивающую повышение степени гидролиза крахмала зернового сырья, сбраживание концентрированного сусла, интенсификацию процесса спиртового брожения, сокращение потерь спирта и сырья, улучшение качества целевого продукта.

На первом этапе исследований проведен анализ концентрированных ферментных препаратов отечественного и импортного производства с целью подбора эффективного ферментативного комплекса для рационального и полного использования составных частей зернового сырья.

Все ферментные препараты, предназначенные для спиртовой промышленности, можно разделить на три основные группы по специфичности их воздействия на различные высокомолекулярные полимеры зернового сырья.

I. Достаточно широко представлены ферментные препараты амилолитического действия, способствующие гидролизу крахмала. К ним относятся ферменты разжижающего, декстринирующего и осахаривающего воздействия на крахмал. Эти ферменты можно условно подразделить на 4 класса:

*Бактериальная a-амилаза, образующая при гидролизе крахмала декстрины с различной степенью полимеризации. Источниками бактериальной a-амилазы являются ферментные препараты: Амилосубтилин (Бердский з-д биопрепаратов), БАН («Новозаймс»), Ликвамил («Энде Индастриал Корпорейшн») и др., с оптимумом действия 60-70°С и рН 5.5-7.0, синтезируемые Bacillus subtilis. Наиболее интересными
и перспективными препаратами являются ФП термостабильной a-амилазы:
Амилолихетерм отечественного производства, Термамил («Новозаймс»),
Зимаджунт («Эндэ Индастриал Корпорейшн») и др., получаемые глубинным

культивированием бактерий Bacillus licheniformis. Оптимальная температура действия этих ферментов 85- 95°С, оптимум рН - 6.0 - 7.0.

*Грибная a-амилаза, обладающая эндоамилазной способностью к гидролизу крахмала с образованием растворимых декстринов, олигосахаридов и мальтозы, с оптимумом действия 45-55°С и рН 4.8-5.5. Источники: Амилоризин, Амилопротооризин - отечественного производства, Фунгамил («Новозаймс»), Диазим («Джененкор») и др.; продуцент: Aspergillus oryzae.

*Глюкоамилаза, предназначенная для осахаривания частично расщепленных полимеров крахмала с образованием глюкозы. Источники: Глюкаваморин - отечественного производства (Бердский з-д биопрепаратов, Мичуринский экспериментальный з-д, ОАО «Восток»), Сан Супер и Сан Ультра («Новозаймс»), Глюкозим, Конверзим («Эндэ Индустриал Корпорейшн»), и др.; продуценты: Aspergillus awamori или A. niger.

*Пуллуланаза, способная гидролизовать внутренние связи в амилопектине и предельных декстринах с образованием мальтоолигосахаридов (Глюкозим нью - производства «Эндэ Индустриал Корпорейшн»).

II. Ко второй группе ферментов относятся ферменты протеолитического действия, гидролизующие белковые полимеры зерна, которые также подразделяются на классы.

*Бактериальные протеиназы, продуцируемые Bacillus subtilis или B.licheniformis (Протосубтилин, Протолихетерм - отечественного производства, Нейтраза и Алкалаза - «Новозаймс», БНЗ - «Эндэ Индустриал Корпорейшн»). Препараты содержат одну или две протеиназы, как правило, нейтральную и щелочную, гидролизующие белки до пептидов. Эти ферменты повышают технологичность сусла, снижают вероятность белкового осаждения, но не обеспечивают дрожжевые клетки легкоусвояемым аминным азотом.

Таблица 1.

ТЕХНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФП

Основной

фермент

Ферментные

препараты

Оптимум

действия

Задачи

применения

ФП в

спиртовом

производстве

Стадия

применения

ФП и норма

расхода, ед/г

крахмала

t°C

РН

Бактериальная

a-амилаза

Термостабильная

a-амилаза

Грибная

a-амилаза

Амилосубтилин

Бан

Ликвамил

Амилолихе-

терм

Термамил

Зимаджунт

Амилоризин

Фунгамил

Клараза

Диазим

60-

85-

50-

5,5-7,0

6,0-7,0

4,8-5,5

Для разжижения

и декстриниза-

ции крахмала

— «-

Для гидролиза

крахмала до

декстринов,

олигосахаридов

и мальтозы

Смеситель;

осахариватель

1-1,5 ед АС/г

Смеситель;

при гидроди-

намической

обработке

0,2-0,3 ед АС/г

Осахариватель

1,0-2,0 ед АС/г

Глюкоамилаза

Пуллуланаза

Глюкаваморин

Сан Супер

Глюкозим

Конверзим

Глюказим нью

55-

58-

4,5-5,0

4,0-6,0

Для осахарива-

ния частично

расщепленного

крахмала до

глюкозы

Осахариватель

5,5-6,2 ед ГлС/г

Бактериальные

протеазы

Грибные

протеазы

Протосубтилин

Нейтраза

БНЗ

Амило-

протооризин

Протооризин

50-

6,5-

10,0

4,7-5,3

Для гидролиза

белков зерна и

снятия белково-

го осаждения

Для протеолиза

белков до

пептидов и

аминокислот,

ассимилируемых

дрожжами

Смеситель;

осахариватель

2,5-6,0 ед ПС/г

белка

Осахариватель

1,5-5,0 ед ПС/г

белка

b-глюканаза

ксиланаза

Целловиридин

Зимафилт

Вискозим

Ультрафло

50-

5,0-7,0

Для гидролиза

некрахмальных

полисахаридов,

снижения

вязкости сусла

Смеситель;

осахариватель

3,0-6,0 ед. рг/г

*Грибные протеазы, например, Амилопротооризин, Протооризин -отечественного производства — Вышневолоцкий з-д ферментных препаратов, Бердский з-д биопрепаратов, содержат комплекс протеиназ и пептидаз (более 5 протеолитических ферментов), которые гидролизуют белки до коротких пептидов и свободных аминокислот, ассимилируемых дрожжевой клеткой. Применение этих ферментов позволяет не только снять коллоидно-белковые образования, но и обеспечить азотистым питанием дрожжи.

III. К третьей группе ферментных препаратов относятся ферменты
целлюлолитического действия, гидролизующие некрахмальные
полисахариды зернового сырья (Целловиридин - отечественного
производства, Вискозим, Ультрафло - "Новозаймс", Зимафилт - "Эндэ
Индустриал Корпорейшн" и др.). Эти препараты снижают вязкость сусла,
повышают доступность крахмала к действию амилолитических ферментов,
тем самым способствуя увеличению выхода спирта. Препараты этой
группы в основном предназначены для повышения эффективности
сбраживания таких видов зерна, как рожь и ячмень. Основные
показатели по характеристике и применению ферментных препаратов в
спиртовом производстве приведены в таблице 1.

Исследовали влияние ферментных препаратов различного спектра действия, используемых при ферментативном гидролизе высокомолекулярных полимеров зернового сырья, на эффективность биоконверсии высокомолекулярных полимеров зернового сырья в этанол.

Для разжижения крахмала использовали ферментные препараты (ФП) Амилосубтилин (Бердский з-д биопрепаратов), Зимаджунт и Ликвамил (Эндэ Инд. Корпорейшн); для осахаривания - различные источники глюкоамилазы: Глюкаваморин (Бердский з-д биопрепаратов), Глюкозим (Эндэ Инд. Корпорейшн), Диазим Х4 (Джененкор) и Глюкоамилаза ГА (Биотехимпекс).

С целью гидролиза белковых веществ растительного сырья дополнительно к амилолитическим ферментам на стадии осахаривания вводили протеазы различного происхождения: Амилопротооризин, Прогосубтилин (Бердский з-д биопрепаратов), БНЗ (Эндэ Инд. Корпорейпш), Experimental GC 710, Протеаза GC-106 (Джененкор), Алкалаза (Новозаймс).

Для гидролиза некрахмальных полисахаридов использовали ферменты целлюлолитического действия: Целловиридин (Бердский з-д биопрепаратов), Ксилоглюканофоетидин (Вьппневолоцкий з-д ферментных препаратов), Конверзим BG-N, Целлюлаза УК, Зимафилт (Эндэ Инд. Корпорейпш), Ламинекс BG, Целлюлаза GC (Джененкор), Шеарзим (Новозаймс).

Активность ферментных препаратов различного спектра действия представлена в таблице 2.

Таблица 2

Характеристика ферментных препаратов

Наименование ФП	Ферментативная активность , ед/г
Наименование ФП	a-амилаза	Глюкоамилаза	Протеаза	b-глю-каназа		Ксиланаза	Целлюлаза
Амилазы
Амилосубтилин	1000	-	-	-		-	-
Ликвамил	2500	-	-	-		-	-
Зимаджунт	600	-	-	-		-	-
Глюкаваморин	25	1000	-	-		-	-
Глюкозим	125	6000	-	-		-	-
Глюкозим N	140	4000	-	-		-	-
ДиазимХ4	119	6000	-	-		-	-
Глюкоамилаза	80	6000	-	-		-	-
Протеазы
Амилопрото-
оризин
КФПА-1	450	0	250	210		77	120
КФПА-2	1200	0	1000	650		66	25
Гфотосубтилин	220	0	210	50		0	8
БНЗ	2000	-	650	-		0	0
Experimental	180	-	400	-		-	-
GC 710
Протеаза GC	10	-	600	-		-	-
Алкалаза	0	-	410	0		0	0
Целлюлазы
Целловиридин	0	-	5	165		260	635
Ксилоглюкано-	0	0	133	270		80	80
фоетидин
Конверзим	6	0	1,5	250		330	14
BG-N
ЦеллюлазаУК	0	0	0	110		250	3500
Зимафилт	1300	50	55	300		4	6
Ламинекс BG	17	0	0	165		375	2700
Целлюлаза GС	0	0	0	230		360	4800
Шеарзим	0	25	0		164	830	4

Характеристика ферментных препаратов термостабильной a-амилазы

Перспективными препаратами, особенно для использования в технологии механико-ферментативной подготовки сырья, являются препараты бактериальной термостабильной a-амилазы.

Исследованы оптимальные условия действия термостабильных амилаз для эффективного гидролиза крахмала зернового сырья. Максимальная эффективность их действия находится в интервале температур 80-95 °С и значении рН 5.0-8.0. Зависимость активности амилолитических ферментных препаратов от температуры отражена на диаграмме (рис. 1).

Рисунок 1.

Температурный оптимум действия амилолитических ферментов

Термостабильные амилолитические препараты различаются по уровню ферментативной активности в различных температурных диапазонах. Так у «препарата-1» амилолитическая активность при повышении температуры до 65°С возрастает в 2,6 раза (с 24% до 63%) по сравнению с активностью определяемой при 30°С. Активность «препарата-2» возрастает в 5 раз в указанных диапазонах температуры (с 18% до 90%).

Высокая термостабильность и оптимум действия этих ФП
способствуют снижению расхода препаратов для разжижения крахмала
зернового сырья в спиртовом производстве. Нормы расхода
термостабильных препаратов по амилолитической активности
соответствуют 0,2-0,3 ед АС/г крахмала, против 1,0-1,5 ед АС/г для
мезофильных амилаз. Уровень активности определялась по ГОСТУ при
30°С (7).

Характеристика ферментных препаратов

глюкоамилазы и пуллуланазы

Для осахаривания крахмала применяют ферментные препараты -

источники глюкоамилазы. Их характеристика в стандартных условиях (30°С)

и эффективность действия при температуре осахаривания (60°С) приведены по усредненным данным в таблице 3.

Таблица 3.

Характеристика ферментных препаратов глюкоамилазы

Т °С гидролиза	Глюкозим (Эндэ)	Сан-Супер (Novo)	Сан-Ультра (Novo)	Диазим Х4 (Джененкор	Амбазим (Джененкор)	Ортидекс (Джененкор)	SKG-2000 (Вильнюс)	Глюкаваморин (Бердск)
30 °	6000	3000	5800	6000	5900	5900	2400	2000
60 °	42300	20600	41000	39900	42000	43000	16600	17000
Увеличение активности	7,0	6,9	7,1	6,7	7,1	7,3	6,9	8,5

В дальнейшем исследовали влияние ферментных препаратов разжижающего и осахаривающего действия различного происхождения на эффективность сбраживания зернового сусла и состав образуемых побочных продуктов брожения.

Для разжижения крахмала использовали ферментные препараты (ФП) Амилосубтилин (Бердский з-д биопрепаратов), Зимаджунт и Ликвамил (Эндэ Инд. Корпорешпн); для осахаривания - различные источники глюкоамилазы: Глюкаваморин (Бердский з-д биопрепаратов), Глюкозим (Эндэ Инд. Корпорейшн), Диазим Х4 (Джененкор) и Глюкоамилаза ГА (Биотехимпекс).

Ферментные препараты дозировали в соответствии с разработанными нормами расхода ФП при приготовлении зернового сусла. Дозировка a-амилазы составляла 1,5 ед.АС, глюкоамилазы - 6,0 ед.ГлС.

Как следует из таблицы 4, при сбраживании пшеничного сусла, осахаренного различными источниками амилолитических ферментов, не наблюдалось существенного различия как в нормативно-технологических показателях брожения, так и в метаболизме дрожжевых клеток. Концентрация сопутствующих летучих веществ, образующихся наряду с этиловым спиртом, составила 4250 - 4700 мг/ дм³; их количество в опытах с использованием различных карбогидролаз варьировало в пределах 10%.

Таблица 4.

Характеристика процесса сбраживания пшеничного сусла, осахаренного различными амилолитическимн ферментными препаратами

Ферментные препараты	Дрожжи, млн/мл	Редуцирующие вещества, %		Общие редуцирующие вещества, %	Выход спирта, см³/100г крахмала	Суммарная конц. основных примесей, мг/дм³
Ферментные препараты	Дрожжи, млн/мл	18 ч	42 ч	42 ч	Выход спирта, см³/100г крахмала	Суммарная конц. основных примесей, мг/дм³
Амилсюубтилин
Глюкаваморин	86	3,9	0,28	0.38	66,9	4250
Амилосубтилин
Глюкозим	82	3,9	0,27	0,36	66,9	4400
Амилосубтилин
Диазим Х4	79	4,2	0,30	0,39	66,7	4650
Амилосубтилин
Глюкоамилаза ГА	77	4,2	0,31	0,39	66,7	4700
Ликвамил
Глюкозим	80	4,0	0,30	0,38	66,8	4500
Зимаджунт
Глюкозим	79	3,9	0,29	0,37	66,7	4450

Пуллуланаза

Определенный интерес представляет такой амилолитический фермент, как пуллуланаза, способный гидролизовать внутренние a-1,6-гликозидные связи в амилопектине и предельных декстинах с образованием мальтоолигосахаридов (8). Атакуемость крахмала ферментом возрастает, если субстрат подвергнут частичному расщеплению, то есть, воздействию других амилаз. Ферментативный комплекс амилолитических ферментов совместно с пуллуланазой катализирует более глубокое расщепление крахмала, способствует интенсификации процесса сбраживания зернового сусла, отмечена также тенденция к увеличению выхода спирта (табл.5).

Таблица 5.

Характеристика процесса сбраживания пшеничного сусла при осахаривании крахмала комплексом глюкоамилазы совместно с пуллуланазой

Расход глюкоамилазы, ед ГлС/г крахмала	РВ,% (после осахаривания)	РВ, %		ОРВ,%		Спирт на 42 ч
Расход глюкоамилазы, ед ГлС/г крахмала	РВ,% (после осахаривания)	18 ч	42 ч	18 ч	42 ч	% об.	мл/100 г крахмала
Глюкоамилаза
4 ед ГлС	9,0	3,8	0,28	5,1	0,49	8,0	66,4
6 ед ГлС	12,8	3,2	0,23	4,4	0,36	8,2	67,3
Глюкоамилаза с
пуллуланазой	11,9	2,9	0,24	3,3	0,39	8,1	67,3
4 ед ГлС	14,5	2,5	0,20	3,0	0,32	8,2	67,6
6 ед ГлС

Концентрация сусла - 17,2%; температура брожения - 34-35°С. Дрожжи

расы 985Т. Длительность брожения 42 часа.

Подобный амилолитический комплекс содержит ФП Глюкозим нью (Эндэ Индустриал Корпорейшн). Характеристика ферментного препарата приведена в таблице 6.

Таблица 6.

Характеристика ФП Глюкозимнью

Наименование показателей

Характеристика

Внешний вид

Цвет

Плотность

Глюкоамилазная активность,

ед ГлС/см³ (по ГОСТ 20264.4-89)

при 30 °С

при 60 °С

Амилолитическая активность,

ед АС/см³ (по ГОСТ 20264.4-89)

Пуллуланазная активность, ед/ см³

Жидкость

Коричневый

1,1

4000

21500

140

Оптимальные условия действия ферментного препарата Глюкозим нью соответствуют рН - 4,0-4,6, температуры — 58-65°С. При повышении температуры гидролиза крахмала до 60°С глюкоамилазная активность ферментного препарата Глюкозим нью возрастает более чем в 5 раз. Эффективность действия ферментов комплекса находится в области рН - 3,5 - 5,0 и температуры - 40-65°С.

Амилолитический комплекс ФП Глюкозим нью содержит наряду с традиционно применяемыми в спиртовом производстве a-амилазой и глюкоамилазой пуллуланазу, синергизм действия которых позволяет повысить степень и скорость гидролиза крахмала. Эти свойства ферментного препарата были использованы при исследовании его эффективности при осахаривании и сбраживании крахмалсодержащего сырья.

Исследования проводили по методу постановки бродильных проб. В качестве субстрата использовали пшеницу, осахаривающих средств - Ликвамил 1200 (источник a-амилазы) и Глюкозим нью (источник глюкоамилазы), в контрольных вариантах использовали Глкжозим Л-400, не содержащий пуллуланазу.

Эксперименты проводили в стандартных условиях, подготовку сырья осуществляли по классической схеме. Расход a-амилазы Ликвамила на разжижение крахмала во всех вариантах составил 1,2 ед АС/г. Ферментные препараты глюкоамилазы дозировали на осахаривание по активности из расчета 4 и 6 ед ГлС/г крахмала. Концентрация сусла составила 17,2%; температура брожения - 34-35°С. Для сбраживания использовали термотолерантные дрожжи расы 985Т. Длительность брожения составила 42 часа.

Из полученных результатов следует, что ферментативный комплекс ФП Глюкозим нью катализирует более глубокое расщепление крахмала до сбраживаемых углеводов, что позволяет снизить дозировку фермента на осахаривание. Использование амилолитического комплекса с пуллуланазой способствует интенсификации процесса сбраживания пшеничного сусла по сравнению с вариантом, где осахаривание проводилось ферментным препаратом Глюкозим Л-400, не содержащим пуллуланазу. Отмечена также тенденция к увеличению выхода спирта.

Таким образом, наличие в составе амилолитического комплекса наряду с а-амилазой и глюкоамилазой пуллуланазы позволяет повысить эффективность осахаривания крахмала перерабатываемого сырья, что способствует интенсификации процесса брожения.

Характеристика ферментных препаратов протеолитического действия

Работами последних лет показана эффективность воздействия протеаз на зерновое сырье в спиртовом производстве (14). В результате гидролиза полимеров сусла повышается содержание легкоассимилируемого азота, что приводит к повышению бродильной активности и продуктивности дрожжевых клеток, способствует к сокращению длительности процесса дрожжегенерации и брожения, а также увеличению выхода этанола.

Особую актуальность приобретает поиск новых биокатализаторов протеолитического действия, осуществляющих глубокий протеолиз растительных белков при значении рН 4,0 и 5,5. Поэтому целью данного этапа работ явилось проведение сравнительных исследований гидролизующей способности ряда протеолитических ферментных препаратов микробного происхождения в кислой и слабокислой зонах рН и выбор наиболее эффективного при гидролизе различных видов зерна и картофеля, применяемых в спиртовом производстве.

В работе использовали различные ферментные препараты (ФП) протеолитического действия микробного происхождения.

При изучении степени гидролиза растительных белков объектами исследований являлись: ячменное, пшеничное и картофельное сусло, а также ячменная болтушка. Модельные опыты проводили по аналогии с технологическими схемами подготовки сырья с развариванием под давлением и по схеме механико-ферментативной обработке, где ведут гидродинамический и ферментативный гидролиз водно-мучной суспензии при температурах до 100°С. Для приготовления сусла использовали 20%-ные по сухой массе растворы измельченных ячменя, пшеницы и картофеля, предварительно обработанные при 125°С в течение 1,5 часа (как принято в спиртовом производстве). Ячменную болтушку готовили без предварительной термообработки. Деструкцию крахмала исследуемых субстратов проводили в течение 1 часа при 55°С с амилолитическими ферментами из расчета 2 ед АС и 6 ед ГлС на 1 г крахмала. Протеолиз осуществляли при 50°С протеолитическими ФП из расчета 5 ед ПС на 1г белка. Степень гидролиза растительных белков оценивали по нарастанию содержания аминного азота, количество которого определяли медным способом (13). В качестве контроля служил исходный субстрат, не обработанный протеазами.

Исследования по содержанию аминокислот в полученных гидролизатах проводили на ячменном и картофельном сусле и ячменной болтушке. Концентрацию общих и свободных аминокислот определяли по методу Мура и Штейна (9) на аминокислотном анализаторе LG 200 фирмы «Biotronik» (Германия); просчет аминограмм осуществляли методом сравнения площадей стандарта и образца.

Из исследованных ФП протеолитического действия были отобраны следующие: Амилопротооризин КФПА из Asp. oryzae, проявивший наибольшую активность по отношению к растительным белкам, а также Амилоризин и Протосубтилин, выпускаемые промышленностью. Изучен аминокислотный состав гидролизатов ячменного и картофельного сусла, ячменной болтушки, получаемых под действием вышеперечисленных препаратов, который представлен в табл. 6-8. Из данных, приведенных в этих таблицах, следует, что количество свободных аминокислот в гидролизатах варьировало от 3,85 до 85,7% в зависимости от используемого субстрата и исследуемого ФП.

Более глубокому гидролизу подвержен белок картофеля. В результате воздействия Амилопротооризина КФПА содержание свободных аминокислот составило 81,0-85,7%, что в 2 раза превысило их концентрацию в исходном сусле (табл.7 ). В основном увеличение аминного азота в полученных гидролизатах происходило за счет высвобождения из связанного состояния глутаминовой и аспарагиновой аминокислот, пролина; содержание их в свободном состоянии увеличилось почти в 3 раза.

Таблица 7.

Влияние протеолитических ферментных препаратов (ФИ) на аминокислотный состав картофельного сусла

Аминокислоты	Концентрация аминокислот в исходном картофельном сусле, г/100г картофеля			Концентрация свободных аминокислот после действия ФП, г/100г картофеля (I ч, 50°С,рН 5.5)
				Протооризин П10х Г ПОх		Амилоризин ПЮх	Протосубтилин ПОх
	общих	свободных
				П10х	Г10х	П10х	Г10х
Аспарагиновая	1,02 0,36			0,98 0,99		0,96	0,38
Треонин	0,41 0.14			0.23 0.24		0.19	0,15
Серин	0,31 0,16			0,18 0,21		0,17	0,17
Глутами новая	1,22 0,39			1,20 1 ,22		1.16	0,52
Глицин	0,38 0,08			0.17 0.18		0,16	0,08
Аланин	0,29 0,20			0,25 0,27		0.24	0.20
Валин	0,38 0,18			0.30 0,31		0,28	0.28
Цистеин	-			-		-	-
Метионин	0,16 0,10			0.14 0.15		0,12	0,10
Изолейцин	0.19 0,10			0,14 0,16		0,14	0,10
Лейцин	0,60 0,24			0,45 0,49		0,44	0,30
Тирозин	0,12 0,03			0,08 0,10		0,07	0,04
Фенилаланин	0,26 0,15			0,19 0,22		0,17	0,15
Лизин	0,29 0.18			0,24 0.25		0.24	0,19
Гистидин	0,16 0,03			0,08 0,12		0,06	0,04
Аргинин	0,35 0,19			0,29 0.31		0,24	0,21
Пролин	0.28 0,11		0,28 0,28			0,22	0,14
Суммарное кол-во	6,42 2.64 5,20 5,50					4,86	3,08
% от общего кол-ва	100 41,1 81,0 85,7					75,7	47,7
Прирост свободных
аминокислот но
отношению к исх.
количеству, %	- - 108,0					84,0	1 6 ,0

Таблица 8.

Влияние протеолитических ферментных препаратов (ФП) на аминокислотный

состав ячменного сусла

	Концентрация		Концентрация свободных аминокислот
	аминокислот		после действия ФП, г/100г ячменя
Аминокислоты	в исходном

	ячменном сусле, г/ 100 г ячменя		I ч, 50⁰С,рН5,5			24 ч., 30⁰С, рН5,5

			Протооризин мило-		Амило- ризин	Прото- субтилин!	Протооризин
	общих	свободн.
			П10х	Г10х

Аспарагиновая	1,88 0,08		0,12 0,13 0,12			0,08	0,20
Треонин	0,85 0,02		0,07 0,06 0,04			0,03	0,23
Серии	1,18 0,08		0,08 0,08 0,06			0,05	0,26
Глутаминовая	7,27 0,08		0,25 0,24 0,20			0,12	0,44
Глицин	1.08 0,02		0,03 0,03 0,03			0,02	0,25
Аланин	1.43 0,05		0,08 0,08 0,07			0,05	0,27
Вал и н	1,12 0,05		0,14 0,13 0,06			0,10	0,57
Цистеин	0,03 -		- - -			-	0,01
Метионин	0.22 0,01		0,03 0,02 0,01			0,01	0,15
Изолейцин	0,47 0,01		0,03 0,06 0,03			0,01	0,38
Лейцин	1.75 0,05		0,15 0,19 0,16			0,10	0,79
Тирозин	0.79 0,03		0,08 0,10 0,06			0.05	0,58
Фенилаланин	1 ,34 0,04		0.09 0,08 0.06			0,04	0,43
Лизин	0,57 0,02		0,07 0,07 0,06			0,03	0,43
Гистидин	0,45 0,01		0,04 0,04 0,03			0.02	0,25
Аргинин	0,80 0,06		0,16 0,18 0,11			0.08	0,59
Проли н	2,З8 0,10		0.16 0.18 0.15			0,12	0,64
Суммарное кол-во	23.61 0,66		1,59 1.66 1.25			0,91	6,39
% от общего кол-ва Прирост свободных аминокислот по отношению к исх. суслу, %	100 2,8		6.73 7,03 5,29			3,85	26,3

			141 152 89			38	868

Наблюдалось также увеличение в 2 раза концентрации треонина, глицина, лейцина, тирозина и гистидина. Несколько менее эффективен был препарат Амилоризин, под воздействием которого прирост свободных аминокислот в гидролизате составил 84% против 108% в ферментолизате, полученном с использованием КФПА.; для Протосубтилина этот показатель был еще ниже - 16%.

При протеолизе ячменного сусла и болтушки отмечено более низкое
содержание свободных аминокислот, чем в картофельных гидролизатах.
Наиболее высокая степень гидролиза ячменного белка была достигнута при
воздействии Амилопротооризина КФПА в течение 24 часов при значении рН
4,0. Вход свободных аминокислот составил 26,3%, т.е. их концентрация
увеличилась почти в 10 раз (табл. 8). При протеолизе ячменного сусла,
проведенного этим препаратом в течение 1 часа, только 7% аминокислот
переходило в свободное состояние. Более низкие показатели отмечены при
использовании КФПА (5,3%) и Протосубтилина (3,8%). При этом
концентрация свободных аминокислот после протеолиза Амило-
протооризином повысилась на 140-150%, в случае с
Протгосубтилином - на 40%.

Белок ячменной болтушки, не подвергавшийся термообработке, более легко гидролизовался протеазами. При воздействии ферментных препаратов из Asp. oryzae содержание свободных аминокислот составило 12,3-13,2%, при протеолизе Амилоризином - 10,9%, Протосубтилином - 5,4% (табл. 9). Можно отметить, что увеличение концентрации свободных аминокислот в гидролизатах после действия Амилопротооризином происходило, в основном, за счет всех анализируемых аминокислот, но особенно аспарагиновой, треонина, серина, глутаминовой, валина, изолейцина, лейцина, тирозина, фенилаланина, лизина, гистидина и аргинина. Содержание их в свободном состоянии увеличивалось в 2-3 раза. В то время как при гидролизе Протосубтилином не происходило заметного освобождения аспарагиновой кислоты, треонина, глицина, аланина, метионина, изолейцина, фенилаланина и лизина.

Таблица 9.

Влияние протеолитических ферментных препаратов (ФП) на

аминокислотный состав ячменной болтушки

	Концентрация		Концентрация свободных аминокислот последействия ФП, г/100г ячменя (1 ч., Т 50°С, рН 5,5)
	аминокислот к исходной ячменной болтушке, г/ЮОг ячменя
Аминокислоты

			Протооризин		Амилоризин	Протсубтилин

	общих свободных	свободных	П10х	Г10х	П10х	Г10х
Аспарагиновая	2.03 0,09		0,17 0,17		0,15	0,09
Треонин	0.89 0,04		0,10 0,11		0,09	0,05
Серин	1,15 0,06		0,13 0,14		0,10	0,08
Глутаминовая	7.29 0,15		0,35 0,35		0,31	0,21
Глицин	1,12 0,03		0,03 0,06		0,06	0,03
Аланин	1,02 0,08		0,17 0,17		0,15	0,08
Валин	1,17 0,08		0.24 0,24		0,18	0,15
Цистеин	0.29		-		-	-
Метионин	0,23 0,02		0,07 0,08		0,04	0,02
Изолейцин	0,49 0,02		0,11 0,19		0,10	0,02
Лейцин	1 ,64 0,06		0.32 0,35		0,30	0,13
Тирозин	0.76 0,04		0,19 0,21		0,18	0,06
Фенилаланин	1,33 0,05		0,17 0,18		0,17	0,05
Лизин	0,81 0,04		0,20 0,19		0,18	0,05
Гистидин	0,50 0,02		0,09 0,09		0,07	0,04
Аргинин	1,00 0,08		0,35 0,37		0,29	0,11
Пролин	2,51 0,2		0,28 0,30		0,26	0,14
Суммарное кол-во	24.23 0,98		2,99 3,20		2,63	1,31
% от общего кол-ва	100 4,0		12,3 3,2		10,9	5,4
Прирост свободных
аминокислот по
отношению к исх.
количеству, %	- -		205 227		168	34

В результате исследований выявлен эффективный ферментный

препарат протеолитического действия Амилопротооризин КФПА. Изучены

оптимальные условия действия этого препарата: максимальная протеолитическая активность проявлялась при значении рН 4,0-6,5, температурный оптимум - 50°С (рис.2).

При исследовании ферментативного комплекса Амилопротооризина КФПА обнаружено наличие не пяти ферментов протеолитического действия, а также a-амилаза, экзо-b-глюканаза, ксиланаза и цитаза. В результате воздействия этого ФП на растительные субстраты гидролизовались не только белки, но и полисахариды с высвобождением аминокислот, гексоз и низкомолекулярных декстринов, необходимых для эффективной жизнедеятельности дрожжевых клеток, применяемых в бродильных производствах.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что наибольшей способностью к глубокому гидролизу растительных белков обладал Амилопротооризин КФПА, выделенный из Asp. oryzae. Наличие в нем сложного гидролитического комплекса позволяет повысить эффективность его использования в спиртовом производстве, где применяется многокомпонентное растительное сырье.

Отработаны технологические параметры глубинного культивирования продуцентов комплекса гидролитических ферментов в промышленных ферментаторах Мичуринского экспериментального завода.

На основе фундаментальных исследований и высокопродуктивных отселекционированных штаммов создана технология промышленного производства и применения ферментных препаратов протеолитического действия для повышения эффективности бродильных производств.

Разработанная технология получения ферментных препаратов кислых
протеаз внедрена на Вышневолоцком заводе ферментных препаратов и
Бердском заводе биопрепаратов. Наработаны опытные партии
ферментных препаратов кислых протеаз Амилопротооризин КФПА, по уровню активности     превышающие существующие аналоги (табл. 10). В
России подобные   ферментные   препараты   промышленностью ранее   не
производились,     несмотря     на    высокую    потребность    спиртовой    и
пивоваренной     отраслей.     Имеющиеся     протеолитические     препараты
импортного     производства     являются     в     основном     бактериального
происхождения и не обеспечивают эффективного гидролиза растительных
белков.

Наработаны 3 вида препаратов, различающиеся по способам очистки и концентрирования:

- (1) с использованием методов микрофильтрации, ультрафильтрации и сушки распылением;

- (2) сушка распылением фильтрата культуральной жидкости Aspergillus oryzae - источника кислой протеазы;

- (3) вакуум-сушка ферментного препарата кислой протеазы, полученного осаждением ферментов этиловым спиртом.

Проведены сравнительные исследования ФП по уровню в них протеолитической активности (табл. 10).

Таблица 10

Сравнительная характеристика препаратов кислой протеазы

Характеристика ФП кислых протеаз 3 ПС,ед/г Белок, % ПС, ед/г Белок, % ПС, Белок, % ед/г 450 30 200 46 1000 40
1		2		3
ПС, ед/г	Белок, %	ПС, ед/г	Белок, %	ПС, ед/г	Белок, %
450	30	200	46	1000	40

Как видно из представленных данных, самая высокая удельная активность в ФП 3 (1000: 40 = 2,5 едПС/мг белка). При получении ФП методом осаждения этанолом были оптимизированы параметры концентрирования и подобрано оптимальное соотношение спирта и культуральной жидкости, что способствовало максимальному выделению фермента. При концентрировании ФП методом ультрафильтрации имели место потери, поэтому в дальнейшем необходимо подобрать мембраны с размером пор, соответствующим молекулярной массе ферментов.

Проведены исследования эффективности применения синтезированных ферментных препаратов в спиртовом производстве. Установлено, что в результате протеолиза белковых веществ зернового сусла дрожжи получают легкоусвояемое азотистое питание в виде аминокислот и коротких пептидов. Полноценное азотистое питание оказывает стимулирующее воздействие на физиологическую активность дрожжевых клеток. Повышается бродильная активность и продуктивность дрожжей на 20-25 % (рис.3). Увеличивается скорость размножения клеток плотность дрожжевой популяции - в 2 раза (рис.4). Особенно это важно на первом этапе, когда скорость процесса, вероятнее всего, лимитируется количеством дрожжей и их состоянием. Значительно интенсифицировался и процесс спиртового брожения, что привело к сокращению длительности процесса до 42 часов (рис. 4, 5).

Наиболее активный период сбраживания углеводов наблюдался в течение первых 18-20 ч, при этом ассимилировалось до 90% углеводов. Далее процесс замедлялся и наступало дображивание, длившееся 20-24 ч. В контрольных опытах процесс дображнвания наступал только после 32-36 ч и длился 36-42 ч.

Введение протеолитических ферментов грибного происхождения на стадии осахаривания крахмала и протеолиза белковых веществ сусла заметно интенсифицировало процесс брожения. Отмечено также, что концентрация побочных метаболитов по сравнению с результатами контрольных опытов, где сусло обрабатывали только амилазами, снижалась на 17-25% (табл. 11). Использование бактериальных протеаз не сказывалось на количестве образуемых побочных продуктов. По-видимому, это связано с составом ферментативного комплекса испытуемых протеолитических препаратов. Так, например, ФП Амилопротооризин является источником карбокси- и аминопептидаз, гидролизующих белок до свободных аминокислот - легко

усвояемого питания для дрожжей. Как было показано ранее, обогащение сусла аминокислотами в результате протеолиза растительных белков, приводит к увеличению выхода основного продукта этанола и снижению образования побочных метаболитов (4). Бактериальный комплекс, как правило, не содержит петидаз, проявляющих активность в слабокислой зоне рН.

Производственные испытания, проведенные на Мичуринском и Козинском спиртовых заводах подтвердили перспективность использования комплекса кислых и слабокислых протеаз для интенсификации процессов дрожжегенерации и спиртового брожения.

Выявлено регуляторное влияние продуктов энзиматического гидролиза растительных белков на физиологическую активность и метаболизм Saccharomyces cerevisiae - промышленных микроорганизмов-продуцентов этанола.

Полученные препараты испытаны для повышения эффективности процесса дрожж

егенерации и интенсификации брожения в спиртовом производстве. Использование кислой протеазы позволило вдвое сократить длительность генерации дрожжей в производственных условиях спиртового завода. Конечные результаты сбраживания ржаного сусла,

достигнутые за 42 ч при дозировке по протеазам 0,8 ед ПС/г крахмала сырья и 56 часов брожения при использовании протеаз в дозировке 0,3 ед ПС/г, соответствовали контрольным показателям бражки на 72 часа без протеаз.

Разработана концепция интенсификации технологических процессов в спиртовой отрасли, основанная на эффективном воздействии грибного про

теолитического комплекса на высокомолекулярные белковые полимеры зернового сырья. При этом достигнуто: ускорение генерации дрожжей и увеличение их биомассы в 1,5-2 раза, повышение бродильной активности и продуктивности клеток на 25%, сокращение длительностио спиртового брожения на 20%.

Таблица 11.

Влияние протеолитических ферментов иа процесс сбраживания пшеничного сусла

Источник протео-литических ферментов	Дрожжи, млн/мл	Редуцирующие вещества, %		Общие редуцирующие вещества, %	Выход спирта, см³/100г крахмала	Суммарная конц. основных примесей, мг/дм³
Источник протео-литических ферментов	Дрожжи, млн/мл	18 ч	42 ч	42 ч	Выход спирта, см³/100г крахмала	Суммарная конц. основных примесей, мг/дм³
Контроль (без протеаз)	78	4,2	0,28	0.39	66,5	4800
Амилопротоори- зин	120	2,2	0,18	0,26	67,3	3600
Протосубтилин	87	3,7	0,26	0,36	66,8	4520
БНЗ	84	3,8	0,26	0,37	66,7	4600
Experimental GC 710	85	4,1	0,27	0,37	66,7	4700
Протеаза GC-106	102	2,6	0,21	0,30	67,0	4000
Алкалаза	91	3,5	0,24	0,33	66,8	4450

Таблица 12.

Влияние целлюлолитических ферментов на процесс сбраживания ржаного

и ячменного сусла

Источник целлюлаз	Редуцирующие вещества, %		Общие редуцирующие вещества, %	Выход спирта, см³/1Оог крахмала	Конц. основных примесей
	24 ч	48 ч			Конц. основных примесей
	24 ч	48 ч			мг/дм³	%
1	2	3	4	5	6	7
Рожь
Контроль	4,7	0,56	0,68	64,6	4617	100
(без целлюлаз)
Целловиридин	4,4	0,52	0,65	64,8	4850	105
Ксилоглюкано-
фоетидин	4,2	0,48	0,63	65,0	4995	108
Зимафилт	4,0	0,43	0,58	65,4	4895	106
Конверзим	4,2	0,45	0,59	65,0	5030	109
BG-N
1	2	3	4	5	6	7
Ламинекс BG	4,3	0,46	0,63	64,9	5280	114
Целлюлаза GC	4,3	0,45	0,62	65,2	4943	107
Шеарзим	4,0	0,42	0,56	65,2	5340	116
Ячмень
Контроль	5,8	0,61	0,72	64,5	4341	100
(без целлюлаз)
Целловиридин	5,6	0,59	0,68	64,7	4199	97
Ксилоглюкано-	5,5	0,58	0,67	64,7	4385	101
фоетидин
Зимафилт	5,7	0,57	0,68	64,9	4400	101
Целлюлаза УК	5,6	0,57	0,66	64,7	4421	102
Конверзим	5,6	0,56	0,65	64,6	4902	ИЗ
BG-N
Ламинекс BG	5,7	0,58	0,67	64,7	4913	113
Целлюлаза GC	5,5	0,56	0,64	65,0	4830	111
Шеарзим	5,4	0,56	0,62	65,0	4650	107

Ферменты, гидролизующие некрахмальные полисахариды

На следующем этапе работы исследовали ФП целлюлолитического действия для гидролиза некрахмальных полисахаридов при приготовлении ржаного и ячменного сусла. Эти виды сырья характеризуются повышенным содержанием целлюлозы, гемицеллюлозы и гумми-веществ, что вызывает высокую вязкость разваренной массы, затрудняет атакуемостъ крахмала амилолитическими ферментами. Поэтому для деструкции трудно гидролизуемых высокомолекулярных полимеров растительного сырья необходимо использование ферментативных комплексов, содержащих такие ферменты, как b-глюканаза, ксиланаза и целлюлаза (5).

Проведенные исследование показали, что применение этих ферментов позволяло повысить степень конверсии углеводов ржи и ячменя в этанол (табл. 12). Однако их использование вносило некоторую корректировку в образование побочных продуктов, но не столь существенную, в пределах 16%.

В результате проведенных экспериментальных работ были подобраны наиболее эффективные ферментные препараты и установлены нормы их расхода по экзо-b-глюканазной, ксиланазной и целлюлазной активностям для гидролиза некрахмальных полисахаридов зернового сырья.

При переработке трудно сбраживаемого сырья, ячмень и ржи, с целью интенсификации спиртового брожения рекомендуется использование ферментных препаратов (Амилопротооризина, Целловиридина, Шеарзима, Зимафшгга, и др.) - источников b-глканазы, ксиланазы и целлюлазы в дозировках:

- по b-глюканазе - 0,06 ед b-ГкС/г,

- по ксиланазе - 0,3 ед КС/г,

- по целлюлазе - 0,7 ед ЦС/г крахмала.

Бродильные производства основаны на жизнедеятельности дрожжевых клеток. Дрожжи относятся к одним из самых старейших микроорганизмов, культивируемых человеком. Много веков назад дрожжи уже применялись при получении пива, вина. Однако впервые дрожжевые клетки увидели в 17 веке, когда Левенгуком был сконструирован микроскоп. Последующие полтора столетия заметного прогресса в исследовании дрожжевых клеток не отмечалось. Только в 19 веке классические исследования Л. Пастера позволили рассматривать процесс спиртового брожения как физиологический процесс, связанный с жизнедеятельностью дрожжевой клетки. Впоследствии были проведены глубокие исследования по обоснованию схемы биохимизма спиртового брожения. Дрожжи сыграли историческую роль в развитии биологических наук, им принадлежит также особая роль в открытии и расшифровке процессов анаэробного и аэробного окисления Сахаров, лежащих в основе существования живого мира.

Особый интерес представляют дрожжи рода Saccharomyces, которые объединяют наибольшее число дрожжей, имеющих промышленное применение в различных отраслях бродильных производств. В результате длительного культивирования в производственных условиях эти дрожжи приобрели характерные признаки, по которым они и отличаются от так называемых «диких» дрожжей.

Для сбраживания крахмалсодержащего сырья в спиртовом производстве до сих пор широко применяют дрожжи S. cerevisiae p.Xl 1, а также расы М -смесь нескольких рас, выделенные в Германии в 1902-1905 г.г. Таким образом, почти 100 лет основная раса спиртовых дрожжей оставалась неизменной.

Фундаментальные исследования по физиологии спиртовых дрожжей, азотистому и фосфорному обмену веществ были проведены проф. Коноваловым С.А. Было подтверждено, что содержание азота в сбраживаемых субстратах в значительной степени определяет скорость синтеза и образование биомассы дрожжей. Показано, что наиболее легко ассимилируемым является азот аминокислот. Азот амидной формы в присутствии аминного азота практически не потребляется. При аэрации потребление амидной формы возрастает.

Наиболее пригодными для дрожжей, с точки зрения расхода энергетических затрат, является азот аминокислот. Процесс использования дрожжами аминокислот в качестве источника азота изучался еще Эрлихом, который показал, что аминокислоты дезаминируются гидролитическим путем, а освободившийся аммиак ассимилируется дрожжами. Но работы, проведенные Торном, Уайтом, Коноваловым, в корне изменили эти взгляды. Была выдвинута теория прямого усвоения аминокислот и доказано, что лучшим источником азота для дрожжей является смесь аминокислот. Проведенные в институте исследования показали, что наиболее интенсивно процесс роста, развития и размножения дрожжевых клеток протекал на средах, содержащих полную смесь аминокислот, а не индивидуальную аминокислоту, использование которой осуществлялось через переаминирование. В результате была показана возможность прямой ассимиляции аминокислот, что позволяет клетке использовать для питания не только азот, но и углерод, а также экономить энергию, расходуемую на синтез аминокислоты. Обогащение питательной среды свободными аминокислотами в результате протеолиза белков зерна протеолитическими ферментами способствует сокращению расхода сахара на построение биомассы дрожжей и образование побочных продуктов, что приводит в конечном итоге к увеличению выхода спирта.

Создание современных прогрессивных технологий для интенсификации процесса брожения диктует необходимость выделения новых более физиологически активных рас дрожжей, а также разработку различных приемов и способов, позволяющих повысить эффективность дрожжевых клеток при сбраживании крахмалсодержащего сырья. Однако в отечественной промышленности недостаточное внимание уделялось созданию новых рас дрожжей.

В последние 10 лет в промышленности были испытаны и внедрены такие новые расы дрожжей, как:

• Г-660, гибридная раса, выделенная в Институте генетики РАН путем половой гибридизации S. cerevisiae и S, pombe, обладающая повышенной декстринолитической активностью;

• ВПУ-408, полученная во ВНИИПБТ методом автоселекции при росте дрожжей р.Х11в условиях повышенных температур;

• термотолерантные расы К-81 (полученные КТИПП и ВНИИПБТ) и XII Т (УкрНИИспиртбиопрод);

• гибридные расы дрожжей Y-717, 985, полученные во ВНИИПБТ.

Эти расы спиртовых дрожжей обладали термотолерантными свойствами, но не отличались достаточной устойчивостью к полученным признакам, особенно при длительном культивировании их в производственных условиях. Кроме того, при хранении дрожжей установлено, что некоторые из них склонны к реверсии, диссоциируют и при рассевах дают колонии, обладающие различными физиологическими свойствами.

Физиологическая активность дрожжевых клеток, используемых при получении этанола, является одним из важных факторов, определяющих эффективность спиртового производства. Бродильная активность и продуктивность дрожжей, плотность дрожжевой популяции оказывают существенное влияние на стабильное протекание процесса брожения, скорость сбраживания крахмалсодержащего сырья и выход целевого продукта.

Однако в процессе жизнедеятельности дрожжей возникают не зависящие от микроорганизмов факторы, негативно влияющие на физиологическое состояние дрожжевых клеток. К таким факторам можно отнести повышение температуры в процессе дрожжегенерации и спиртового брожения (особенно в летний период времени), которое негативно сказывается на развитии дрожжевых клеток и их жизнедеятельности, что приводит к замедлению брожения, неполному сбраживанию и снижению техноэкономических показателей производства.

Кроме того, в результате создаваемых извне или возникающих в процессе жизнедеятельности дрожжей условии субстратного лимитирования, ингибирования продуктами метаболизма и другими физико-химическими показателями среды {температура, рН, кислотность и др.) происходят необратимые процессы, негативно сказывающиеся на качестве дрожжевых клеток. Продолжительная генерация промышленных рас дрожжей также ведет к ослаблению культур и утрате их технологических возможностей.

Во ВНИИПБТ осуществлены работы по выделению новых, более физиологически активных рас спиртовых дрожжей. Одним из путей, позволяющих повысить эффективность дрожжевых клеток при сбраживании крахмалсодержащего сырья является проведение работ по селекции и отбору физиологически активных клонов спиртовых дрожжей, технологически устойчивых к неблагоприятным факторам, обладающих повышенной продуктивностью, осмофильностью и термотолерантностью. Получение таких активных рас спиртовых дрожжей даст возможность повысить эффективность спиртового производства в результате интенсификации процессов дрожжегенерации и брожения, сокращения потерь спирта и сырья.

В связи с вышеизложенным на первом этапе работы проведены сравнительные исследования различных промышленных рас спиртовых дрожжей, выделенных из производственных культур спиртовых заводов и полученных из музеев ВНИИПБТ, ВНИИ генетнки, УкрНИИспиртбиопрод, по бродильной активности, продуктивности и термотолерантности.

Проведенный анализ используемых рас дрожжей на заводах отрасли показал, что основными промышленными культурами являются Saccharomyces cerevisiae расы: ХП, Y-717, К-81, 660, 86, 985. Следует отметить, что основная масса колоний промышленных рас дрожжей отличалась по культуральным и морфологическим свойствам. Наибольшей бродильной активностью в стандартных условиях на солодовом сусле (30°С, 16-17% СВ) обладали дрожжи расы ХП и K-8'l, а продуктивностью - ХП, К-81, 985 и Y-717 (рис. 1). Более устойчивыми к повышенным температурам проявили себя дрожжи S. cerevisiae Y-717, 985, К-81 и ХП-Т.

Селекционные работы по скринингу физиологически активных вариантов проводили из промышленных культур, гибридных штаммов и лабораторных популяций, подвергнутых длительным генерациям при повышенных температурах или концентрациях среды.

При проведении селекционных работ основным признаком служила осмофильность и исследуемых штаммов дрожжей их термотолерантность. На первом этапе исследований проводили сравнение спиртовых дрожжей рас ХП, К-81, Г-660, Y-717 и 985 при культивировании их на средах с концентрацией сухих веществ 22-24%. Лучшие результаты получены при использовании дрожжей рас ХП и 985 (рис.2).

Отбор дрожжей проводили по бродильной активности и продуктивности клеток на 10 и 24 часа брожения в период их максимальной физиологической активности. Наибольшей продуктивностью обладали дрожжи расы 985, которые были использованы в качестве родительского штамма для дальнейших селекционных работ.

Динамика сбраживания сусла отобранными расами дрожжей приведена на рис. 3. Как видно из рисунка, лучшие результаты получены при использовании дрожжей рас ХП и 985. Концентрация несброженных углеводов (РВ) к 72 часам брожения составила 0,59 и 0,52%, а этанола - 10,8 и 11 ,2 % об., соответственно.

Один из способов повышения рентабельности спиртового производства является использование высококонцентрированного зернового сусла. Важным условием эффективного сбраживания сусла повышенной концентрации должно быть применение дрожжей, обладающих высокой осмофильностью.

Известно, что повышение концентрации сбраживаемого сусла и возрастание содержания спирта приводит к затормаживанию процессов дрожжегенеращш и брожения. Увеличение концентрации синтезируемого спирта угаетающе действует на рост, размножение и бродильную активность дрожжевых клеток. Уже при концентрации спирта более 5% об. наблюдается ингибирование процесса почкования клеток; при концентрации этанола выше 12% об. - полное подавление роста дрожжей (15).

Снижение физиологической активности дрожжей зависит как от концентрации спирта, так и от состава среды. Рост дрожжей в сусле повышенных концентраций лимитируется недостатком азотистого питания. При увеличении концентрации сусла повышается степень влияния азотистого питания на размножение дрожжевых клеток и процесс брожения. Использование зернового сусла, обогащенного аминньш азотом в результате протеолиза растительных белков сырья, способствует повышению бродильной активности дрожжей, их осмофильности и толерантности к спирту. Применение комплекса протеиназ и пептидаз для обработки сусла с концентрацией сухих веществ 24% позволило сбраживать среды дрожжами S.cerevisiae p.Xll с нормативными технологическими показателями брожения за 72 часа. Дальнейшее повышение концентрации сусла приводило к замедлению процессов дрожжегенерации и брожения (16).

Таким образом, получение дрожжей, толерантных к основному продукту их жизнедеятельности, является одной из возможностей интенсифицировать биохимические процессы спиртового брожения.

Рисунок.2..

Продуктивность спиртовых дрожжей при сбраживании

зернового сусла с концентрацией СВ 22%

Селекцию и скрининг дрожжей, обладающих осмофилъными свойствами, проводили по способности отобранной расы сбраживать высококонцентрированное сусло. Адаптацию родительской расы к повышенному осмосу осуществляли путем многократного пассажирования клеток на жидких питательных средах с возрастающей концентрацией сухих веществ (24-32%).

Динамика потребления общих углеводов и накопления спирта различ-

ными расами дрожжей на высококонцентрированном пшеничном сусле

В результате из большого числа выделенных вариантов культур путем поэтапного отбора были отселекпионированы популяции дрожжей, наиболее устойчивые к супраоптимальному осмосу и температуре, и получена активная термотолерантная и осмофильная раса дрожжей 985Т и ее варианты, а также осмофильная раса 987О (рис.4),

Для поддержания их в активном состоянии были подобраны питательные среды, обеспечивающие сохранение приобретенных свойств культур в течение длительного времени.

В дальнейшем исследовали устойчивость отселекционированной расы 985 Т к повышенным концентрациям спирта. Для этого дрожжи культивировали на ячменном сусле с концентрацией сухих веществ 18,6% с внесением в среду на 24 часа культивирования различные количества этанола (от 3 до 7 % об.). Контроль за процессом осуществляли по росту, размножению и состоянию дрожжей, потреблению углеводов и образованию спирта (табл. 1).

Через 24 часа брожения количество несброженных углеводов составило 3,2 %, а концентрация спирта - 6,5 % об. При изучении влияния различных концентраций спирта на жизнедеятельность отселекционированного штамма было установлено, что при концентрации этанола в среде 11,5 % об. культура продолжала размножаться и сбраживать остаточные углеводы, но увеличивалось содержание мертвых клеток до 30%. Концентрация спирта на 72 часа брожения составила 13,9 % об. против 9,2 % об. в контрольном варианте без введения дополнительных количеств этанола. Анализируя полученные результаты, можно сделать вывод, что испытанная раса 985Т устойчива к концентрациям спирта до 14% об., о чем свидетельствует прирост спирта в бражке, адекватный введенному количеству. Аналогичные результаты были получены с дрожжами р. 987 О.

В дальнейшем исследовали процесс сбраживания ржаного сусла с концентрацией сухих веществ 24% и 31% дрожжами рас 985 Т и 987 О. В качестве осахаривающих средств использовали ферментные препараты Зимаджунт в количестве 0,5 ед. и 0,7 ед. АС/г и Глкжозим - 9 ед. и 12 ед. ГлС/г крахмала, соответственно.

Влияние различных концентраций спирта на жизнедеятельность дрожжей S.cerevisiae 985T-4

Таблица 1.

Добавка	Количество дрожжей, млн./мл			Характеристика брожения
этанола на	на 24	на 48 часов роста
24 ч. б	часа			РВ, г/ 100мл		Спирт % об.
брожения,	роста		мертвых,					При]
% об.		всего	%	48 часов	72 часа	48часов	7!2часа	спир
- з 5 7	110 98 105 11О	81 74 74 68 38	- 13,6 29,5 41,0	0,27 0,66 1,81 2,9	- 0,5 0,85 3,05	6.,5 9,5 11.5 13.5	9,2 12,0 13,9 14,0	0 2,9 4,7 4,8

Известно, что обмен веществ у дрожжей находится в прямой зависимости от азотистого питания. При повышении концентрации зернового сусла увеличивается содержание потребляемых углеводов и возрастает потребность дрожжей в легкоассимилируемом аминном азоте. В связи с этим изучали влияние дополнительных источников азота при сбраживании сусла с концентрацией сухих веществ 31%. Для этого в осахаренное сусло вводили мочевину (0,1%), а также использовали протеолитическии комплекс ферментного препарата Амилопротооризин, гидролизующий белки сусла до аминокислот и коротких пептидов (5). Контролем служили дрожжи расы ХП. Полученные результаты приведены в табл.2.

Дрожжи рас 985Т и 987 О сбраживали сусло с концентрацией сухих веществ 24% с нормативными показателями на 72 часа брожения.

С повышением осмоса (СВ 31%) дрожжи претерпевали некоторые изменения: клетки становились более зернистыми, стенки уплотнялись, замедлялось их развитие, увеличивалось количество мертвых клеток. Особенно это отразилось на дрожжах р.ХП: на 24 ч роста концентрация дрожжевых клеток составила 45 млн/мл, почкующихся - 7% (для осмофильных дрожжей - 67-68 млн/мл, почкующихся — 10-12%). Внесение дополнительного азотистого питания увеличивало прирост биомассы дрожжей и способствовало их почкообразованию.

Полученные сравнительные данные по потреблению углеводов подтверждают, что отселекционированные расы дрожжей проявляют большую устойчивость к повышенному осмосу, чем р. ХП, что сказалось на результатах сбраживания высококонцентрированного ржаного сусла. Так, через 24 ч брожения количество остаточных углеводов в опытных вариантах составило 12,8-13,6 % РВ, в то время как в контрольном - 18Д % РВ; к 72 ч их концентрация снизилась до 1,1-1,2 %РВ и 2,8% РВ, соответственно. Внесение дополнительного азотистого питания позитивно сказалось на интенсивности процесса брожения (табл.2). Применение осмофильных рас дрожжей позволило повысить концентрацию спирта до 15% и увеличить его выход на 72 ч брожения.

Таблица 2

Влияние различных рас дрожжей на процесс брожения

высококонцентрированного сусла

Раса дрож –жей	Источник азота	Конц-ция СВ,%	Количество дрожжей, млн/мл						РВ, г/ 100мл			Спирт % V	Выход спирта мл/100 г крахмала
			на 24 ч роста		на 48 ч роста		на 72 ч роста		24ч	48ч	72ч
			всего	почк., %	всего	почк., %	всего	мертв.	24ч	48ч	72ч
985Т	-	24	11О	12	112	6	108	7	6,1	0.78	0.48	11.85	68.7
987О	-	24	113	10	115	8	110	8	6,0	0,76	0,45	11.98	68.9
985Т	-	31	68	10	71	8	70	30	13.6	3,7	1.2	15.02	67.7
985Т	мочевина	31	70	15	80	11	75	24	12,5	3.5	1,0	14,8	67,8
985Т	амило-прото-оризин	31	78	19	86	12	87	21	11.2	3,0	0.9	15,03	68,0
987О	-	31	67	12	81	9	78	28	12.8	3.5	1Л	15,11	67,9
XII	-	31	45	7	63	7	60	55	18.1	5,2	2,8	13,5	62,8

В настоящих исследованиях изучали влияние таких технологических факторов, как температура, концентрация сухих веществ зернового сусла и этанола на метаболизм широко используемой в промыпшенностй ХП расы и новых отселекционированных штаммов 985-Т и 987-О. Анализ процесса сбраживания сусла осуществляли с учетом изменения основных технологических показателей, содержания спирта и побочных метаболитов дрожжей, определяющих связь энергетического и конститутивного обмена дрожжевой клетки.

Реальным способом интенсификации биотехнологического процесса является использование термотолерантных рас для сбраживания зернового сусла при повышенных температурах. При этом необходимо контролировать процессы накопления не только этанола, но и других продуктов, синтезируемых при брожении, чтобы не только сократить сроки брожения, но и получить высококачественный спирт (17). Известно, что мезафильные дрожжи при повышенных температурах теряют свою физиологическую активность, что ведет к ослаблению клеток и изменению их метаболизма (18).

Таблица 3.

Сравнительная характеристика сбраживания ржаного сусла (СВ = 17,2%) различными расами

дрожжей при температурах 30 и 35⁰С

t брожения	Дрожжи (раса)	Дрожжи в бражке, млн/lOOcte³		РВ г/1 00см³			ОРВ г/100 см³			Выход спирта см^э/100г		Суммарная концентрация основных
												примесей мг/дм³
		18 часов	42 часа	18ч.	42ч.	66ч.	18ч.	42ч.	66ч.	42ч	66ч	42ч	66ч
35'С	985 -Т	78/28% почк.	75/1,5% мертв.	3,7	0,51	0,49	5,2	0,60	0,58	66,6	66,9	3272,7	3734,2
	987-0	62/15% почк.	58/5% мертв..	5,7	0,66	0,59	8,0	0,79	0,68	65,5	65,9	3710,3	3884,9
		60/8%	62/12%
	ХП	почк.	мертв.	6,9	0,78	0,62	9,2	0,86	0,69	65,2	65,9	4631,9	6710,8
зо°с	985 -Т	81/18% почк.	93/5% почк.	5,05	0,72	0,52	7,35	0,81	0,62	65,3	66,7	3646,1	3992,2
зо°с	987-0	79/17%	82/6%
		почк.	почк.	4,9	0,72	0,51	7,40	0,82	0,63	65,2	66,6	3828,3	4175,0
		80/14%	89/4%
	XII	почк.	почк.	5,2	0,76	0,53	7,40	0,85	0,62	65,2	66,5	4273,5	5011,7

Кроме того, снижается конкурентоспособность дрожжевой культуры по отношению к посторонней микрофлоре, возрастает опасность инфицирования, что приводит к потерям сырья и отрицательно сказывается на качестве спирта в связи с образованием посторонних метаболитов. Поэтому изучали влияние температуры на метаболизм дрожжей рас ХП, 985-Т и 987-О. Сбраживание ржаного сусла осуществляли при обычной температуре 29-30°С и повышенной - 35-36⁰С.

Все расы дрожжей обеспечивали при 30°С нормальное протекание процесса брожения, и к 66 часам выход спирта составил 66,5-66,7 см³/!'00 г крахмала (табл.3). Однако исследуемые расы различались по уровню накопления основных примесей (ацетальдегид, метилацетат, этилацетат, пропанол, изобутанол, бутанол, изоамилол). Суммарное количество побочных метаболитов, синтезируемых расами 985-Т и 9&7-О, в 1,25 раза было ниже аналогичного показателя у расы ХП (табл. 4).

Повышение температуры брожения до 36°С существенно отразилось на физиологической активности дрожжей и более резко выявило их различие. Особенно отрицательно это сказалось на расе ХП: снизилась способность дрожжей к размножению, их упитанность, вырос коэффициент гибели клеток и к 42 ч роста составил 12% против 1,5 % у расы 985-Т. В то время, как термотолерантная раса 985-Т более активно размножалась, интенсивно ассимилировала углеводы, и уже к 42 ч брожения процесс был практически прекращен: выход спирта составил 66,6 см³/100 г крахмала, к 66 ч - 66,9 см³/100 г. При использовании расы 987-О и ХП выход целевого продукта за этот же период был на уровне 65,2-65,5 см³/100 г крахмала (к 66 ч - 65,9 см³/100г), что на 2%ниже, чему расы 985-Т (табл.3).

Исследуемые расы дрожжей отличались друг от друга и по количеству синтезируемых побочных метаболитов. При повышенной температуре меньше всего примесей образовывала термотолерантная раса 985-Т: суммарное количество основных летучих веществ было почти в 2 раза ниже, чем у расы ХП (табл.3). Концентрация побочных метаболитов, синтезируемых дрожжами 987-О, незначительно превышала аналогичные показатели расы 985-Т/ Отмечена также тенденция повышения уровня накопления основных вторичных продуктов при увеличении продолжительности брожения, особенно для расы ХП.

Таким образом, применение термотолерантной расы 985-Т позволяет не только интенсифицировать процесс брожения и повысить технологические показатели, но и улучшить качество целевого продукта. Повышенные температуры отрицательно сказываются на расе ХП, что ведет к недоброду и ухудшению технологических показателей брожения. При этом выход спирта снизился на 1 %, а суммарная концентрация основных примесей повысилась в 1,35 раза по сравнению с процессом, проводимым при 30°С.

Таблица 4

Образование основных примесей при сбраживании ржаного сусла различных

концентраций дрожжами расы 985Т и ХП при температурах 30 и 35°С.

			Концентрация СВ сусла, %
Основные примеси, мг/дм³			СВ - 17,2							СВ = 22,8			СВ = 26,5
			35°С				зо°с			зо°с			30°С
			985Т			ХП	985Т		ХП	985Т	ХП		985Т		XII
1			2			3	4		5	6	7		8		9
1 -Пропанол			424,2			748,0	360,5		446,4	432,8	473,7		398,9		666,1
2-Пропанол			0			0	0		0	0	0		0		0
1 -Бутанол			4,4			4,6	9,3		9,7	8,8	7,1		10,6		9,7
2-Бутанол			0			0	0		0	0	0		0		0
Изобутанол			763,9			1781,6	780,3		1212,2	613,3	1179,3		604,5		1118,5
1-Пентанол			1,9			4Д	2,0		4,8	1,8	1,9		1,8		2,4
Гексанол			2,5			8,5	2,8		7,5	4,1	7,2		5,2		3,4
Изоамилол			2107,6			3247,7	2532,7		2958,5	2715,8	3337,6		2498,0		3403,1
1		2		3			4	5		6	7	8		9
Метанол, % об.			0,13			0,13	0,09		0,09	0,12	0,14		0,04		0,06
Ацетальдегид			138,7			501,8	70,0		141,3	78,8	407,1		196,6		434,5
Кротональдегид			0			0	0		0	0	0		0		0
Б ензал ь дегид			0			0	0		0	0	0		0		0
Мети лацетат			193,0			286,6	162,2		168,7	231,2	288,8		191,1		325,3
Эти л ацетат			102,4			140,5	77,2		74,9	90,6	95,9		151,4		203,7
Этиловый эфир			0			0	0		0	0	0		0		0
Метилпропионат			0			0	0		0	0	0		0		0
Этилпропионат			0			0	0		0	0	0		0		0
Ацетон			0			0	0		0	0	0		0		. 0
Метилэтилкетон			0			0	0		0	0	0		0		0
Уксусная к-та			95,7			101,0	90,3		131,0	95,0	96,0		94,5		89,7
Пропионовая к-та			190,6			209,4	174,8		176,9	192,7	255,7		255,2		221,4
Изомасляная к-та			23,6			25,8	22,4		22,8	27,0	31,5		31,2		45,5
Масляная к-та			И,5			12,2	10,5		12,7	11,5	11,8		14,0		14,2
Валериановая к-та	19,9				21,2		17,8	23,3		18,2	19,1	24,2		20,4
Изовалерианавая	70,0				70,6		69,8	71Д		68,9	77,5	65,3		88,5
Бензалкоголь	9,5				10,5		8,8	10,7		7,6	6,1	10,6		11,4
Ф енилал коголь	465,8				460,5		447,6	487,7		480,6	467,5	401,8		449,9
Суммарное количество	4625,2				7634,6		4838,9	5960,2		5078,4	6763,8	4954,9		7107,7
Количество дрожжевых клеток, млн/мл	75				62		93	89		66	58	55		45
Количество примесей на ед. клеток, мг/дм^э/млн	62				123		52	67		77	117	90		158

Как видно из таблицы, дрожжи 985-Т более рационально ассимилировали углеводы среды, направлено синтезируя этанол с одновременным снижением уровня образования вторичных продуктов брожения. Концентрация практически всех идентифицированных метаболитов была ниже, чем у расы ХП. Особенно это сказалось на синтезе высших спиртов, эфиров и альдегидов.

Различие исследуемых рас резко проявилось при повышении температуры и осмоса. Более_ч негативное воздействие экстремальные условия оказали на ХП расу, что привело к увеличению образования практически всех побочных метаболитов, особенно адетальдегида, метилацетата, этилацетата, пропанола. У расы 985-Т эта тенденция менее выражена: уровень накопления побочных продуктов обмена при повышенных температуре и осмосе был практически в 1,5 раза ниже, чем у р. ХП.

Как показали исследования, при совершенствовании технологических процессов следует осуществлять контроль производства не только по накоплению этилового спирта и сбраживанию углеводов сырья, но и по показателям конститутивного обмена, т.е. по концентрации побочных соединений, образующихся в результате роста и размножения дрожжей. Такой подход обеспечит не только полноту сбраживания сусла, но и хорошие органолептические свойства готового продукта. Поэтому, выбор и использование расы дрожжей, наиболее подходящей к конкретным условиям предприятия, может повысить рентабельность производства и улучшить качество спирта.

Таким образом, расы 985-Т и 987-О с осмофильными и термотолерантными свойствами способствуют повышению эффективности спиртового производства не только в результате интенсификации технологического процесса и возможности сбраживания высококонцентрированного сусла, но и улучшения качества конечного продукта.

Проведены производственные испытания отселекщюнированных рас дрожжей на спиртовых заводах, где ранее применялись XII, К-81 и Y-717 расы. Новая раса дрожжей Saccharomyces cereviske 9S5 Т проявила высокую кислого- и термоустойчивостъ, а также конкурентоспособность к посторонней микрофлоре. Подгоерждена эффективность использования этой расы для интенсификации спиртового брожения. Длительность сбраживания ржаного сусла сокращалась на 1&-20 часов (табл. 5).

При совершенствовании технологических процессов следует осуществлять контроль производства не только по накоплению этилового спирта и интенсивности сбраживания углеводов сырья, но и по показателям конститутивного обмена, т.е. по концентрации побочных соединений, образующихся в результате роста и размножения дрожжей. Такой подход обеспечит не только полноту сбраживания сусла, но и хорошие органолептические свойства готового продукта. Поэтому, выбор и использование расы дрожжей, наиболее подходящей к конкретным условиям предприятия, может повысить рентабельность производства и улучшить качество спирта.

Использование термотолерангаых и осмофильных рас 985Т и 987О для сбраживания зернового сусла при повышенных температурах и осмосе позволяет не только сократить сроки брожения, но и получить высококачественный спирт.

Различие исследуемых рас резко проявляется при повышении температуры и осмоса. Более негативное воздействие экстремальные условия оказывают на ХП расу, что приводит к увеличению образования практически всех побочных метаболитов, особенно ацетальдегида, метилацетата, этилацетата, пропанола. У расы 985Т эта тенденция менее выражена: уровень накопления побочных продуктов обмена при повышенных температуре и осмосе был практически в 1,5-2 раза ниже, чем у р. ХП.

Дрожжи расы ХП, М, К-81 и др. при повышенных температурах и осмосе теряют свою физиологическую активность, что ведет к ослаблению клеток, изменению их метаболизма, снижению конкурентоспособности дрожжевых клеток по отношению к посторонней микрофлоре. Это приводит к потерям сырья и отрицательно сказывается на качестве спирта в связи с образованием посторонних метаболитов. Суммарное количество побочных метаболитов, синтезируемых расами 985-Т и 987-О, почти в 2 раза ниже аналогичного показателя у расы ХП при повышении температуры брожения до 35-36°С. Кроме того, использование дрожжей расы 985-Т и 987-О при сбраживании высококонцентрированного сусла также позитивно сказывается на качестве целевого продукта: суммарная концентрация основных примесей снижается практически в 1,5 раза по сравнению с ХП расой.

В настоящее время подтверждена технологическая устойчивость дрожжей Saccharomyces cerevisiae 985 Т в промышленных условиях в течение года с сохранением приобретенных свойств.

Таблица 5

Сравнительнная характеристика сбраживания высококоицентрированного сусла различными расами дрожжей при температуре 30°С

Сырье конц. СВ, %	Дрожжи (раса)	Дрожжи в бражке, млн/100см³		РВ г/100см³			СРВ г/100см³			Спирт		Концентрация побочных метаболитов мг/дм³
		Дрожжи в бражке, млн/100см³		РВ г/100см³			СРВ г/100см³			72ч		Концентрация побочных метаболитов мг/дм³
		18 часов	42 часа	18ч.	42ч.	66ч.	18ч.	42ч.	66ч.	%V	выход см³/100г	72 часа
Рожь, 22,8%	985 -Т	62/12% почк.	66/3.5% мертв.	9.6	1.27	0,62	11,7	1,59	0,76	11,0	66,5	4171,3
	987-0	65/14% почк.	64/4% мертв.	9.4	1.29	0,61	11,8	1,56	0,74	11,1	66,6	4121,4
	ХП	58/8% почк.	58/8% мертв.	9.6	1.66	0,91	11,7	2,05	1,06	10,8	66,0	5889,5
Рожь, 26,5%	985 -Т	58/8% почк.	55/5% мертв.	9,18	1,45	0,73	11,4	1,75	0,88	12,8	66,8	4051,3
	987-0	54/10% почк.	53/4% мертв.	9,7	1,50	0,71	11,9	1,76	0,86	12,7	66,8	3863,1
	ХП	49/8% почк.	45/8% мертв.	10,9	1,98	1,18	12,1	2,9	1,28	11,5	65,3	6260,9

Разработана Технологическая схема и Технологическая инструкция по применению дрожжей Saccharorayces cerevisiae 985 Т в спиртовом производстве (рис.5).

В инструкцию включены разделы по морфологической и кулътуральной характеристике отселекционированной расы, описаны условия хранения чистой культуры дрожжей в лаборатории, приведены разделы по разведению чистой культуры в производственных условиях, приготовлению засевных и производственных дрожжей и режимам брожения.

Анализируя результаты производственных испытаний, опыт работы заводов, данные экспериментальных исследований можно сделать следующие выводы:

- для повышения эффективности спиртового брожения рекомендуется использование новых термотолерантных и осмофильных рас дрожжей Saccharomyces cerevisiae 985 Т и 987 О;

- применение термотолерантных и осмофильных рас дрожжей при нормативных дозировках осахаривающих средств позволяет сократить процесс брожения до 50-60 часов;

- повысить температуру сбраживания сусла до 35-56 °С и сократить длительность брожения до 48 ч;

- увеличить концентрацию сбраживаемого сусла и повысить концентрацию спирта в бражке;

- для устойчивой работы завода с активными расами спиртовых дрожжей рекомендуется один раз в год проводить разведение чистой культуры. Своевременное обновление промышленных рас дрожжей позволит поддерживать их в активном состоянии и сохранять термотолерантные и осмофилъные свойства в течение длительного пассажирования в производственных условиях, что будет способствовать повышению производительности бродильного отделения.

Рисунок 5.

Технологическая схема приготовления производственных дрожжей

____

Промышленную проверку разработанной технологии проводили на Мичуринском экспериментальном заводе, а также на ряде заводов отрасли (Костромском, Анненковском, Куйбышевском, Донском и др. спиртовых заводов).

Производственные испытания проводились по двум направлениям:

1. Интенсификация спиртового брожения с использованием комплексного ферментного препарата Амилопротооризина КФПА - источника комплекса протеолитических ферментов, экзо- и эндо-b-глюканаз, a-амилазы, ксиланазы и ферментов целлюлолитического действия.

2. Интенсификация спиртового брожения с использованием новой отселекционированной расы термотолерантных и осмофильных дрожжей S. cerevisiae 985-Т.

На первом этапе проведены производственные испытания по наработке комплексного ФП Амилопротооризин КФПА в условиях ферментного цеха МЭЗ. Культивирование продуцента Aspergillus oryzae sp. проводили в промышленных ферментаторах объемом 32 м³. Длительность ферментации составила, в среднем, 46-50 часов. Средняя ферментативная активность в культуральной жидкости составила по a-амилазе - 9-10 ед АС/мл, по протеазам 11-12 едПС/мл, по глюканазам - 7 ед/мл, ксиланазе - 3 ед/мл и целлюлозе - 5 ед/мл.

Полученная глубинная культура в количестве 35 т была передана в спиртовый цех для гидролиза белковых веществ и некрахмальных полисахаридов зернового сусла. В цехе на период испытаний перерабатывали зерносмесь пшеницы, ржи и ячменя в соотношении 68%, 7% и 25% соответственно. Амилопротооризин КФПА задавали в производство на стадии осахаривания в вакуумосахариватель совместно с глубинной культурой A. awamori - источником глюкоамилазы. Концентрацию сусла поддерживали на уровне 17-18%. Полученное с амилопротооризином сусло характеризовалось отличной степенью осахаривания и подавалось на поток, а также в дрожжанки и возбраживатели.

Отмечена интенсификация процесса дрожжегенерации при использовании КФПА амилопротооризин. В результате воздействия комплексного ферментного препарата Амилопротооризин на растительные белки зернового сусла среда обогащалась легкоусвояемыми для дрожжей аминокислотами, что сказалось на повышении бродильной активности дрожжей. Дрожжевые клетки отличались от контрольных повышенной упитанностью, высоким содержанием почкующихся клеток, отсутствием мертвых. На 11 часов роста опытные дрожжанки были готовы, отброд составил 5-6% СВ, в то время как в контрольных дрожжанках этот показатель составил 9-11% СВ.

Интенсифицировалось накопление биомассы дрожжей: концентрация клеток в опытных дрожжанках составила 127-140 млн/мл, в контрольных - 103-115 млн/мл на этот же период. Перед засевом концентрация дрожжевых клеток в опытных дрожжанках 157-185 млн/мл.

Аналогичные закономерности интенсификации роста и размножения дрожжей, а также повышения их качества наблюдалось и в возбраживателях. На 11 часов роста дрожжей в возбраживателях отброды снизились с 17,5% до 4-5% СВ. Концентрация клеток составила 148-163 млн/мл. В контрольных возбраживателях на этот же период концентрация клеток составила 72-94 млн/мл, отброд - 7,5% СВ. К 16 часам показатели в контрольных возбраживателях составили 5-5,5% СВ, а концентрация клеток - 112-140 млн/мл. Характеристика процессов дрожжегенерации представлена в таблице 1. Таким образом, как следует из полученных результатов, отмечена интенсификация процесса дрожжегенерации на 30-40%.

Сказалась эффективность использования КФПА для осахаривания и протеолиза крахмалсодержащего сырья и на технохимических показателях производственного потока. Отмечено, что средняя концентрация дрожжевых клеток в 1-ом и во 2-ом чанах опытного потока поддерживалась на уровне 70-84 млн/мл (табл.2). В контрольном потоке, где не использовали Амилопротооризин эти показатели составили 38-64 млн/мл. Такое стабильное поддержание концентрации дрожжевых клеток в головных чанах указывает на возможность продления залива потока до 4-х суток.

При использовании КФПА повышалась и скорость сбраживания сусла. Так, в первых четырех чанах средняя концентрация растворимых сухих веществ бродящей массы снизилась практически в 2 раза по сравнению с контрольным потоком. Средние показатели отбродов уже с 5-го чана составляли 0,6% СВ (в контроле — 3,4%), при этом концентрация углеводов в опытном потоке снижалась до 0,5 г/100 мл. Аналогичные показатели в контрольном потоке были достигнуты только к концу брожения

Таблица 1

Характеристика развития дрожжей в производственных дрожжанках

№ дрож-

жанки и дата

кладки

Продол-житель-

ность роста, ч.

Конц-ция СВ,

Кислот-

ность

Дрожжи,

млн/мл

Характеристика

дрожжевых

клеток

Контрольные дрожжанки

№1

31,01 0 15,0 0,75

11 9,0 0,9 115 Упитанность слабая

15 5,0 0,9 141 мертвых клеток – 8%

№2

31,01 0 15,0 0,65

11 11,2 0,85 103 Упитанность слабая

15 6,0 0,85 122 мертвых клеток – 5%

Опытные дрожжанки

№1

03,02 0 15,2 0,85

11 6,0 0,9 140 Упитанность хорошая,

Захоложено мертвых клеток нет

5,0 1,0 185

№2

03,02 0 15,0 0,8

11 7,0 0,85 127 Упитанность средняя,

Захоложено мертвых клеток нет

4,5 0,9 157

Контрольные возбраживатели

№1/№2 0 18/17,5 0,7/0,7

12 7,5/7,5 0,7/0,7 72/94 Упитанность средняя,

16 5,0/5,5 0,8/0,9 112/140 мертвых клеток нет

Опытные возбраживатели

№1/№2 0 17,5/17,0 0,7/0,7 Упитанность средняя,

11 5,0/4,0 0,9/0,8 163/148 мертвых клеток нет

Таблица 2

Средние показатели отброда в производственных чанах

№ чана	Отброд, % СВ
№ чана	Контрольный поток	Опытный поток
I	7,4	5,0
П	6,6	4,0
ш	4,0	2,0
IV	3,4	0,9
V	2,0	0,6
VI	1,3	0,4
VII	0,6	0,35
VIII	0,45	0,2

Таблица 3

Динамика технологического процесса сбраживания зернового сусла в производствен-

ных потоках

Длительность брожения, час	Контрольный поток		Опытный поток
Длительность брожения, час	РВ, %	Спирт, об.%	РВ : ,	Спирт, об. %
0	7,8		8,4
12	6,1		3,0
13	5,0		1,3
24	2,2		0,8
30	1,5		0,54
36	1,1	6,2	0,36 8,2 8,2
42	0,55	7,1	0,30 8,5 8,5
48	0,47	7,5	0,28 8,6 8,6
52	0,40	7,7	0,27 8,6 8,6
60	0,32	8,3	0,26 8,7

*Дозировки ФП:

в контрольном потоке – 1,0 ед АС/г крахмала (Амилосубтилин)

7,0-8,0 ед ГлС/г (Глюкаваморин)

в опытном потоке - 1,0 ед АС/г, 0,5-0,8 ед ПС/г (Амилопротооризмн)

7,0-8,0 ГлС/г (Глюкаваморин)

осмофильной расы дрожжей S. cerevisiae 985-Т. Испытания проводили в производственных условиях спиртзаводов по Технологической схеме, представленной на рис. 1.

Технологическая схема приготовления производственных дрожжей S. cerevisiae 985-T состоит из следующих стадий:

1. Разведение чистой культуры

2. Приготовление засевных дрожжей

3. Получение маточных дрожжей

4. Приготовление сусла для производственных дрожжей

5. Получение производственных дрожжей

Описание технологического процесса приготовления производственных дрож жей

В спиртовом производстве засевные дрожжи ведут по методу естественно-чистой культуры, что предусматривает создание условий, необходимых для размножения дрожжей, но угнетающих развитие посторонней микрофлоры. Такие условия достигают при поддержании значения рН дрожжевого сусла от 3,4 до 4,2. Подкисление дрожжевого сусла производят серной кислотой, реже молочной кислотой, образующейся за счет предварительного размножения на дрожжевом сусле молочнокислых бактерий.

При периодическом процессе брожения в качестве засевных дрожжей используют зрелые дрожжи из дрожжанки (дрожжегенератора) перед спуском ее содержимого в бродильный чан.

Разведение дрожжей из чистой культуры

Разведение дрожжей из чистой культуры применяют в начале производственного сезона, после длительного простоя или при инфицировании производственных дрожжей.

При нормальной работе завода чистую культуру разводят из пробирки 1 раз в 4-6 месяцев. Однако допускают увеличение сроков периодичности разведения культуры до 8-12 месяцев.

Чистую культуру дрожжей S. cerevisiae 985-Т получают из
ВНИИПБТ по заявкам спиртовых заводов.

Все операции по разведению чистой культуры дрожжей должны проводиться в отдельном помещении (боксе), при закрытых дверях и окнах с соблюдением микробиологической чистоты.

Разведение чистой культуры дрожжей S. cerevisiae 985-Т в производственных условиях спиртзаводов проводили путем последовательных пересевов с возрастающим объемом среды с колбы до производственной дрожжанки (дрожжегенератора) в соответствии с «Инструкцией по технохимическому и микробиологическому контролю спиртового производства», Москва, 1986 г. и «Технологической инструкцией по ведению чистой культуры термотолерантных дрожжей Saccharomyces cerevisiae 985-Т в спиртовом производстве» (ТИ 10-12606-2000), а также разработанной в рамках настоящего Договора «Технологической инструкцией по применению термотолерантной и осмофильной расы дрожжей S. cerevisiae 985-Т в спиртовом производстве». Состав питательных сред на всех стадиях разведения чистой кулыуры сохраняли согласно действующему на заводе регламенту.

При разведении чистой культуры на работающем заводе на первых стадиях разведения (колба-бутыль) использовали дрожжевое сусло, отбираемое после дополнительного осахаривания, а на стадии маточник-дрожжанка - подкисленное дрожжевое сусло с введением дополнительного питания.

Приготовление производственных засевных дрожжей

Для разведения дрожжей в начале производственного цикла использовали сусло, приготовленное из ржаной муки и воды. На 1 кг муки берут 5 л воды. Муку смешивали с водой при температуре 35-40 °С и раствором бактериальной a-амилазы из расчета 3-4 ед АС /г крахмала сырья. Смесь нагревали при постоянном перемешивании и выдерживали при этой температуре в течение 1 часа, затем охлаждали до температуры 56-58°С, после чего вносили растворы глюкоамилазы из расчета 12-15 ед ГлС/г крахмала сырья и протеазы Амилопротооризина КФПА из расчета 0,8 ед ПС/г крахмала. При этой температуре сусло осахаривали 2-3 часа. Конец осахаривания определяли по йодной пробе, которая должна иметь желтую окраску. Осахаренное сусло фильтровали через плотную ткань. Концентрация сусла была в пределах 10-12% сухих веществ. Готовое сусло разливали по 0,5 л в литровые колбы и стерилизовали в автоклаве при 0,05 МПа в течение 30 мин. Через 18 ч брожения засевные дрожжи стадии были готовы.

Для приготовления засевных дрожжей П-ой стадии через 18-20 часов бродящее сусло переливали в бутыль с 5 л стерильного нефильтрованного сусла, подкисленного до значения рН от 3,8 до 4,6.

Получение маточных дрожжей

При приготовлении сусла для получения маточных дрожжей использовали отъем осахаренного сусла из основного производства.

Сусло готовили из ржаного сырья с концентрацией сухих веществ от 16 до 18% (по сахарометру или рефрактометру) по режимам разваривания и осахаривания, принятым на заводе.

Для повышения степени осахаривания в отъем зернового сусла, взятого
с основного производства, вносили дополнительное количество
ферментного препарата - источника глюкоамилазы из расчета от 3,0 до 6,0
ед/г крахмала. На этой же стадии для гидролиза белковых веществ в
отдельных: случаях, при наличии на заводе Амилопротооризина, задавали ФП
протеолитического действия (Амилопротооризин КФПА), что позволяет
интенсифицировать скорость размножения дрожжей за счет обогащения сусла лекоусвояемым азотистым питанием. Дозировка ФП, содержащего активные пептидазы, составляла 0,3 ед ПС/г крахмала. Количество дрожжевых клеток ври этом увеличивалось до 120-150 млн/мл, количество почкующихся клеток — до 15-18%.

Доосахаривание проводили при температуре 58-60°С в течение 1,5-2 часов. При проведении доосахаривания дополнительные количества ФП вносили непосредственно в дрожжанку перед заполнением ее суслом.

В качестве азотистого питания для дрожжей, где не использовали КФПА Амилопротооризин, задавали после осахаривания карбамид из расчета 600-700 г/м³ или диаммоний фосфат - 250-300 г/м³ сусла. Ферментные препараты и минеральные соли задавали в виде чистого водного раствора, приготовленного в соотношении 1:10. Дозировка минеральных солей может корректироваться в зависимости от вида перерабатываемого сырья и физиологического состояния дрожжей.

Приготовленное таким образом сусло пастеризовали при температуре 85 °С в течение 30 минут, затем подкисляли серной кислотой до значения рН от 3,6 до 4,2, тщательно перемешивая.

Полученное дрожжевое сусло использовали для засева маточных дрожжей. Объем засевных дрожжей составил 8-10% к объему сусла в маточнике. Температура складки 20-24°С. Температура дрожжегенерании -30-32°С. Длительность дрожжегенерации составила 10-12 ч (против 18-24 ч в контрольных вариантах). Величина видимой плотности (отброда) зрелых маточных дрожжей составила к этому времени 1/3 от исходной концентрации сусла.

Количество клеток в 1 мл зрелых (засевных) дрожжей составила при использовании КФПА - 170 млн/мл, без протеаз (с минеральным питанием) -80-120 млн/мл. Зрелые дрожжи были хорошей упитанности, обладали высокой бродильной активностью, количество мертвых клеток не превышало 1%. Маточные дрожжи передавали на стадию приготовления производственных дрожжей.

Длительность дрожжегенерации новых термотолерантных дрожжей S. cerevisiae 985-T сократилась в 1,5-2 раза по сравнению с используемыми ранее на этих заводах дрожжей S. cerevisiae рас ХП, К-81 и Y-717.

Приготовление производственных засевных дрожжей

Сусло для производственных дрожжей готовили аналогично приготовлению сусла для маточных дрожжей, описание которого приведено выше.

Температура складки производственных засевных дрожжей при засеве маточной кулыуры S. cerevisiae 985-Т составила 20-24°С. Температура брожения на стадии дрожжегенерации - 30-32°С, количество засевных дрожжей на этой стадии соответствовало 8-10% от рабочего объема дрожжанки (дрожжегенератора).

Содержание дрожжевых клеток в зрелых дрожжах было, в среднем, 80 130 млн/мл, мертвых клеток - не более 1%, упитанность (по окраске с йодом) была удовлетворительной. Значение рН готовых производственных дрожжей поддерживали на уровне от 3,4 до 4,2, что является одним из условии, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность дрожжей. В случае использования недостаточно качественного сырья для повышения чистоты брожения рН зрелых дрожжей понижали до величины 3,2-3,4 путем внесения дополнительного количества серной кислоты.

Полученные готовые производственные дрожжи направляют в бродильные чаны основного производства из расчета 8-10% от рабочего объема чана для засева осахаренного сусла. Часть дрожжей оставляют в дрожжегенераторе в виде матки для засева свежей партии сусла.

Длительность процесса дрожжегенерации новых термотолерантных дрожжей S. cerevisiae 985-T на стадии приготовления производственных засевных дрожжей сократилась, в среднем, на 30-40% по сравнению с используемыми ранее на этих заводах дрожжей S. cerevisiae рас ХП, К-81 и Y-717.

Сбраживанне производственного сусла

Процесс сбраживания зернового сусла осуществляли в бродильных чанах периодическим способом, при котором в каждый бродильный чан подавали одновременно с суслом производственные дрожжи.

Использование термотолерантных и осмофильных дрожжей расы 985-Т позволило интенсифицировать процесс брожения. Для этого повышали температуру складки до 24-26°С, температуру головного брожения до 33-36°С (но не выше 37°С). После 36-42 часов при дображивании температуру снижали до 30-32°С, чтобы снизить риск инфицирования бражки. Продолжительность сбраживания составила, в среднем, 50-60 часов против 72-78 ч брожения, имеющих место на заводах до введения новой расы дрожжей.

Таким образом, внедрение новой расы термотолераных дрожжей S.
cerevisiae 985-Т позволило сократить длительность процессов
дрожжегенерации и брожения на 30-40% по сравнению с используемыми
ранее на этих заводах дрожжей S. cerevisiae рас ХП, К-81, 1985 и Y-717.

Для сокращения длительности брожения до 42-48 часов необходимо на стадии осахаривания:

- введение Амилопротооризина (КФПА) в дозировке 0,3 ед ПС/г крахмала;

- увеличение длительности осахаривания до 2-х часов;

- увеличение расхода глюкоамилазы до 7,0 ед ГлС/г крахмала.

При переработке трудно сбрасываемого сырья, такого как ячмень и
рожь, с целью интенсификации спиртового брожения рекомендуется
использование ферментных препаратов (Амилопротооризина, Целловиридина, Шеарзима, Зимафилта, и др.) – источников глюканазы, ксиланазы и целлюлазы в дозировках:

- по b-глюканазе - 0,06 ед b-ГкС/г крахмала,

- по ксиланазе - 0,3 ед КС/г крахмала.

Таким образом, в результате производственных испытаний разработанной биотехнологии интенсивного сбраживания зернового сусла с применением комплексных ферментных препаратов и новых рас дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами в производственных условия спиртовых заводов:

1. Подобран комплексный ферментный препарат Амилопротооризин КФПА, использование которого для гидролиза белковых и некрахмальных полимеров зернового сырья, позволяет увеличить скорость размножения дрожжевых клеток и накопления биомассы на 60-80%, повысить бродильную активность и продуктивность дрожжей на 20-25%, сократить длительность процессов дрожжегенерапии и брожения на 30-40%.

2. Осуществлен скрининг новой расы термотолерантных и осмофильных дрожжей S. cerevisiae 985-Т, устойчивой к повышенным температурам, осмосу и концентрациям спирта. Установлена высокая конкурентоспособность отселекционированной расы дрожжей к посторонней микрофлоре. Внедрение этой расы позволяет сократить длительность дрожжегенерации и спиртового брожения на 30-40%,

стабилизировать процесс брожения (особенно в летний период времени), сократить потери сырья, повысить качество целевого продукта – этанола.

ВЫВОДЫ

1. Подобран комплексный ферментный препарат Амилопротооризин КФПА, обеспечивающий эффективный гидролиз белковых и некрахмальных полимеров зернового сырья.

2. Показано, что использование наряду с традиционно применяемыми амилолитическими ферментами комплексного ферментного препарата, содержащего карбоксильную, сериновую и металлопротеиназы, лейцинамино- и карбоксипептидазы, экзо- и эндо-b-глюканазу, ксиланазу и целлюлазу, позволяет получать высококонцентрированное зерновое сусло, обогащенное легкоусвояемым аминным азотом, осуществлять гидролиз некрахмальных полисахаридов (целлюлозы, гемицеллюлоз и гумми-веществ) трудносбраживаемых видов сырья -ячменя и ржи, получать сусло с пониженной вязкостью и высокой концентрацией растворимых сухих веществ.

3. Разработаны нормы расхода ферментных препаратов для интенсификации спиртового брожения.

4. Применение комплексных ферментных препаратов, содержащих активные протеазы, позволяет увеличить скорость размножения дрожжевых клеток и накопления биомассы на 60-80%, повысить бродильную активность и продуктивность дрожжей на 20-25%, сократить длительность процессов дрожжегенерации и брожения на 30-40%.

5. Осуществлен скрининг новой расы термотолерантных и осмофильных дрожжей S. cerevisiae 985-Т, устойчивой к повышенным температурам, осмосу и концентрациям спирта.

6. Установлена высокая конкурентоспособность отселекционированной расы дрожжей к посторонней микрофлоре.

7. Внедрение расы дрожжей S. cerevisiae 985-T позволяет сократить длительность дрожжегенерации и спиртового брожения на 30-40%, стабилизировать процесс брожения (особенно в летний период времени), сократить потери сырья, повысить качество целевого продукта - этанола.

8. Проведены производственные испытания комплексного ферментного препарата Амилопротооризин КПФА и новой расы дрожжей S. cerevisiae 985-Т для интенсификации процессов дрожжегенерации и спиртового брожения.

9. Термотолерантная раса дрожжей S. cerevisiae 985-Т внедрена на ряде

заводов спиртовой отрасли.

10. Разработана Технологическая инструкция по применению

термотолерантной и осмофильной расы дрожжей S. cerevisiae 985-Т в спиртовом производстве и апробирована в производственных условиях.

ЛИТЕРАТУРА

1. Усачев А.М. Состояние и подготовка законопректов алкогольной отрасли //Производство спирта и ликероводочных изделии. 2002. - № 1. -С. 4-5.

2. Поляков В.А., Римарева Л.В., Ксандопуло Г.Б. Перспективные биотехнологнческие процессы для спиртовой промышленности //Производство спирта и ликероводочных изделий. 2002. - № 1. -С. 6-8.

3. Римарева Л.В. Создание микробных ферментных препаратов и их роль в повышении эффективности спиртового производства //Сб.: Научно-технический прогресс в спиртовой, и ликероводочной отрасли промышленности. М., Пищепромиздат. -2001. — С.36-52.

4. Римарева Л.В., Яровенко В.Л., Милюкова Т.Б., Устинников Б.А. Использование протеолитического ферментного препарата из A.oryzae в спиртовом брожении //Прикл. Биохимия и микробиология. - 1993. - 29, №6.-С. 869-876.

5. Иванова Е.Г., Киселева Л.В., Ленец КГ., Петрова Г.А. Влияние гемицеллюлаз на гидролиз некрахмальных полисахаридов //Пиво и напитки. - 2002. - № 2, с. 19-22.

6. Лихтенберг Л. А. Влияние технологаческих приемов на качество спирта //Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2001. - № 2, с.28-29.

7. ГОСТ 20264-89. Ферментные препараты.

8. Яровенко В.Л., Войнарский И.Н., Римарева Л.В. Определение протеолитической активности ферментных препаратов для спиртового производства //Спирт. и ликеровод. пр-сть. ЦНИИТЭИ Пищпром. -1977. -№5.-С. 9-12.

9. Moore S., Stein W.H.// J. Biol Chem. 1951. V. 192. № 2. P. 663-671.

10. Рухлядева А.П. Техно-химический контроль спиртового производства.

М., Пищевая пр-сть. - 1974. - 355 с.

11. ГОСТ Р 51786-2001. Водка и спирт этиловый из пищевого сырья.

Газохроматографический метод определения подлинности.

12. ГОСТ Р 51762- 2001. Водка и спирт этиловый из пищевого сырья. Газохроматографический метод содержания летучих кислот и фурфурола.

13. Белозерский А.Н., Проскуряков Н.И// Практическое руководство по биохимии растений. М.: Сов. наука, 1951. С. 130-131.

14. Андреев Н.Р., Ладур Т.А., Филлипова Н.И. Переработка ржи на крахмал. - М.: АгроНИИТЭИПП. -1995. - Вып.1.

15. Фертман ГЛ, Шойхет М.Й. Биохимические основы бродильных производств. //Пищепромиздат. М. —1970. — 240 с.

16. Коновалов С.А. //Биохимия дрожжей. М. Пищевая промышленность. -1980. - 240 с.

17. Римарева Л.В. Биотехнология комплексных препаратов кислых протеаз и их роль в интенсификации технологических процессов в перерабатывающих отраслях АПК. Автореф. Докт. Диссерт. М. – 1997. - 51с.

18. Римарева Л.В., Войнарский И.Н., Устинников Б.А.// Ферментная и спиртовая пр-сть. -1983. - №2. - С.9.

19. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Игнатова Н.И., Кадиева А.Т., Шелехова Т.М., Веселовская О.В. Рациональный выбор расы спиртовых дрожжей //Производство спирта и ликероводочных изделии. -2001.-№2, с. 19-21.

20. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Гернет А.М.//Пиво и напитки. - 2000. -№1. - С.34.

21. Римарева Л.В.// Произ-во спирта и ликеро-вод. изд. - 2000. - №1. — С.18.

22. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Серба Е.М. Трифонова В.В.// Прикл. биохимия и мкробиол. - 1997. — Т.ЗЗ. - №1. - С. 43.

23. Римарева Л.В., Оверченко М.Б.//С6. «Состояние и перспективы

развития биотехнологических процессов в пищевой промышленности». М. Пищепромиздат. 2001. С. 93.

24. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Трифонова В.В., Игнатова Н.И. //Производство спирта и ликероводочных изделий. 2001. №1. С. 21

25. Грачева И.М. //Прикладная биохимия и микробиология 1983. Т.19. №1. С.ЗЗ.

26. Римарева Л.В., Макеев Д.М., Устинников Б.А. //Пищевая пром-сть. -1993.-№2.-С.29.

27. Римарева Л.В., Оверченко М.Б. //Ликероводочное производство и виноделие. -2000. - №6. - С.8.

28. Plant A.R., Clemens R.M., Daiel R.M., Morgan H.W. Purification and preliminary characterization of an extracellular pullulanase from Thermoanaerobium //Appl. Microbiol. And Biotechnol. 1987. - 26., N5, 427-433.

29. Spreinat A., Antranikian G. Purification and synergistic action of

pullulanases and maltohexaose forming -amylase //Starke. -1992. - 44. N8. C.305-312.

Скачать дипломную работу

Если Вас интересует помощь в НАПИСАНИИ ИМЕННО ВАШЕЙ РАБОТЫ, по индивидуальным требованиям - возможно заказать помощь в разработке по представленной теме - Процесс получения зернового сусла и других составляющих для производства спирта ... либо схожей. На наши услуги уже будут распространяться бесплатные доработки и сопровождение до защиты в ВУЗе. И само собой разумеется, ваша работа в обязательном порядке будет проверятся на плагиат и гарантированно раннее не публиковаться. Для заказа или оценки стоимости индивидуальной работы пройдите по ссылке и оформите бланк заказа.