Полный текст:
1.1. Классификация ферментов. Характеристика
класса «лиазы». Приведите примеры уравнений реакций с участием лиаз разных
подклассов. 3
2.1. Витамин
B6 (пиридоксин).
Распространение в природе, суточная потребность, структура витамина и
кофактора, участие в метаболических процессах, симптомы гипо – и авитаминоза. 9
3.1. Особенности
химического строения и функций гликосфинголипидов. 14
4.1. Покажите
механизм образования связей между протомерами при формировании четвертичной
структуры белковой молекулы на примере гемоглобина или другой молекулы.. 17
5.1. Напишите
химическую формулу пентапептида: изолейцил – фенилаланил – треонил – аргинил –
метионин. Покажите механизм образования пептидной связи. Дайте определение
первичной структуре белка. ... 22
6.1. Рассчитайте
энергетическую эффективность окисления ацетил ~ SKoA при согласованной работе ферментов
цикла Кребса и дыхательных цепей и выразите в количестве синтезированных
молекул АТФ. Представьте схему. 29
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК.. 39
Биохимия
1. Ферменты.
Общие свойства ферментов.
1.1. Классификация ферментов. Характеристика класса «лиазы». Приведите
примеры уравнений реакций с участием лиаз разных подклассов
Одной
из специфических особенностей живой клетки является ее способность осуществлять
сложнейшие реакции за очень короткое время и при сравнительно низкой
температуре. Это достигается благодаря образованию в живых организмах особо
активных катализаторов, называемых ферментами.
Ферменты
— это биологические катализаторы, синтезируемые в клетке и представляющие собой
либо простые, либо сложные белки, в состав которых входят неаминокислотные
компоненты.
Ферменты
как биологические катализаторы имеют ряд особенностей, которые отличают их от
катализаторов неорганической природы:
ферментативные
реакции протекают в физиологически нормальных для живого организма условиях и
не требуют жестких условий — повышенной температуры, высокой кислотности среды,
избыточного давления;ферменты
как катализаторы строго специфичны, они катализируют только определенные
биохимические реакции, действуя лишь на определенный субстрат;ферментативные
реакции в живых организмах идут последовательно, таким образом, что субстратом
для каждого последующего фермента является конечный продукт предшествующей ему
ферментативной реакции;скорость
ферментативных реакций высока, но она зависит от количества или активности
фермента, концентрации субстрата, рН и состава раствора, температуры,
присутствия активаторов и ингибиторов. Ферментативные реакции идут со 100%-ным
выходом и не дают побочных продуктов реакции;все
ферменты являются белками. Молекулярная масса ферментов колеблется в широких
пределах от 12 · 103 до 10 ·106 Да;ферменты
образуют в клетке мультиферментные системы, как правило, связанные с клеточными
структурами.
Классификация
и номенклатура ферментов основана на типе реакции, которую они катализируют,
так как катализируемая реакция — это тот специфический признак, по которому
один фермент отличается от другого. За основу номенклатуры принимается
суммарная реакция, выражаемая формальным уравнением, которое в сочетании с
названием субстрата служит основой для построения названия отдельных ферментов.
Ферменты
делят на группы в зависимости от типа катализируемой реакции и на подгруппы,
более точно характеризующие эту реакцию. Каждый фермент получает название,
состоящее из названия субстрата, слова, определяющего тип катализируемой
реакции, и окончания -аза.
Ha
типе катализируемой реакции основана не только классификация, но и кодовая
(цифровая) нумерация ферментов. Окончание -аза должно употребляться только для
отдельных ферментов, т. е. индивидуальных белков-катализаторов, поэтому его не
следует применять для систем, содержащих более одного фермента.
Международная
комиссия по ферментам рекомендовала использование двух номенклатур:
систематической и тривиальной. Систематическое название фермента более точно
указывает на действие фермента и тем самым его идентифицирует. Тривиальные
названия ферментов, используемые в повседневной практике, должны быть
достаточно краткими. Во многих случаях тривиальные названия — это ранее
принятые названия ферментов: каталаза, амилаза, липаза. Протеолитические
ферменты согласно тривиальной номенклатуре сохранили названия с окончанием -ин:
папаин, пепсин, трипсин и др.
Международная
комиссия по ферментам разработала систему присвоения кодовых чисел (шифров) индивидуальным
ферментам. Шифр каждого фермента содержит четыре числа, разделенные точками. Он
составляется по следующему принципу:
А. Первое число
показывает, к какому классу принадлежит данный фермент. Различают шесть классов
ферментов:
1. Оксидоредуктазы — к этому классу
принадлежат ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции и
переносящие электроны или протоны водорода.
2. Трансферазы — ферменты, переносящие ту или
иную группу: метальную, гликозидную, аминную, фосфорную — от одного соединения
(донора) к другому (акцептору этой группы).
3. Гидролазы — ферменты, катализирующие
гидролитическое расщепление связей и некоторых других. Рекомендуемое название
этих ферментов во многих случаях образуется из названия субстрата с
присоединением окончания -аза. Следовательно, если мы встречаемся с ферментом,
состоящим из названия субстрата с окончанием -аза, значит, мы имеем дело с
гидролитическим ферментом (сахаразой, мальтазой).
4. Лиазы — ферменты, отщепляющие (но не путем
гидролиза) от субстрата ту или иную группу с образованием двойных связей или,
наоборот, присоединяющие определенные группы по двойным связям.
5. Изомеразы — ферменты, катализирующие
геометрические или структурные изменения в пределах одной молекулы, т. е.
реакции изомеризации.
6. Лигазы (синтетазы) — ферменты,
катализирующие соединение друг с другом двух молекул, сопряженное с гидролизом
пирофосфат-ной связи в молекуле АТР.
Б. Второе
число, которое присваивается ферменту по классификации, обозначает подкласс.
У
оксидоредуктаз оно указывает на природу той группы в молекуле донора, которая
подвергается окислению (1 — обозначает группу, 2 — альдегидную или кетонную
группу и т. д.); у трансфераз — природу транспортируемой группы; у гидролаз —
тип гидролизуемой связи; у лиаз — тип связи, подвергающийся разрыву (между
отщепляемой группой и остатком молекулы); у изомераз — тип катализируемой
реакции изомеризации; у лигаз — тип вновь образуемой связи.
В. Третье
число обозначает подподкласс. У оксидоредуктаз оно указывает для каждой группы
доноров тип участвующего акцептора (1 обозначает кофермент NAD+ или
NADP+; 2 — цитохром; 3 — молекулярный кислород и т. д.); у
трансфераз третье число обозначает тип транспортируемой группы; у гидролаз это
число уточняет тип гидролизуемой связи, а у лиаз — тип отщепляемой группы; у
изомераз оно уточняет характер превращения субстрата, а у лигаз — природу
образующего соединения.
Г. Четвертое
число обозначает порядковый номер фермента в данном подподклассе.
Шифровая
классификация имеет очень важное преимущество — она позволяет исключить
необходимость при включении в список вновь открытых ферментов менять номера
всех последующих. Новый фермент может быть помещен в конце соответствующего
подподкласса без нарушения всей остальной нумерации.
Лиазы — отдельный класс ферментов,
катализирующих реакции негидролитического разрыва различных химических связей
(C—C, C—O, C—N, C—S и других), обратимые реакции образования и разрыва двойных
связей, сопровождающиеся отщеплением или присоединением групп атомов по её
месту, а также образованием циклических структур. При этом замыкаются двойные
связи и выделяются такие простейшие продукты, как СО2, Н2О,
NH3 и т.п.
Одну
из важнейших групп ферментов этого класса являются углерод-углерод-лиазы
(С–С-лиазы). Среди них особое значение имеют карбокси-лиазы (декарбоксилазы) и
альдегид-лиазы.
В
природе широко распространены декарбоксилазы кетокислот и аминокислот,
катализирующие реакции по следующим схемам:
Характерным
представителем альдегид-лиаз является альдолаза, катализирующая обратимую
реакцию расщепления фруктозо-1,6-дифосфата до фосфотриоз:
Другую
важную группу лиаз составляют углерод-кислород-лиазы (гидро-лиазы), ускоряющие
реакции гидратирования и дегидратирования органических соединений. В качестве
представителя гидро-лиаз приведем фумарат-гидратазу:
Примером
углерод-азот-лиаз может служить аспартат-аммиак-лиаза, ускоряющая реакцию
прямого дезаминирования аспарагиновой кислоты:
Некоторые
лиазы ускоряют реакции не только распада, но и синтеза. Например, из дрожжей
выделена L-серин-гидро-лиаза, отщепляющая от серина воду и присоединяющая
сероводород, в результате чего синтезируется аминокислота – цистеин.
Подобные
ферменты называют синтазами.
2. Витамины.
Коферментная функция витаминов.
2.1. Витамин B6 (пиридоксин). Распространение в природе, суточная
потребность, структура витамина и кофактора, участие в метаболических
процессах, симптомы гипо – и авитаминоза
Пиридоксин
— одна из форм витамина B6. Представляет собой
бесцветные кристаллы, растворимые в воде.
B
пищевых продуктах витамин В6 встречается в трёх видах: пиридоксин, пиридоксаль, пиридоксамин, которые примерно одинаковы по
своей биологической активности.
Пиридоксин
Пиридоксальфосфат
Пиридоксин
хорошо растворяется в воде и этаноле, устойчив в кислой и щелочной среде, но
легко разрушается под действием света при рН=7,0.
Метаболизм.
Всосавшись в тонком кишечнике, все формы витамина с током крови разносятся к тканям
и, проникая в клетки, фосфорилируются с участием АТФ и пиридоксалькиназ.
Коферментные
функции выполняют два фосфорилированных производных пираоксина:
пиридоксальфосфат и пиридокеаминфосфат.
Витамин
В6 часто называют «королем обмена аминокислот». Вместе с тем его коферментные
формы участвуют в реакциях, катализируемых почти всеми классами ферментов.
Механизм действия всех пиридоксальфосфатзависимых ферментов сходен:
1)
вначале образуются шиффовы основания между аминокислотой и коферментом, при
этом нитрофильный азот пиридонового кольца действует как своеобразный
электронный сток, уводя электроны от аминокислоты и стабилизируя промежуточный
интермедиат — карбаиион;
2)
будучи неустойчивыми, шиффовы основания (альдимины) далее модифицируются в
процессах трансаминирования, декарбоксилирования, изомеризации и во многих
других превращениях боковой цепи аминокислот.
Коферментные
формы витамина В6 входят в состав следующих ферментов:
аминотраисфераз
аминокислот, катализирующих обратимый перенос NHj-группы от аминокислоты на
а-кетокислоту, при этом образуются новые а-кетокислоты и заменимые аминокислоты;декарбоксилаз
аминокислот отщепляющих карбоксильную группу аминокислот, что приводит к
образованию биогенных аминов (гистамина, серотонина, ГАМК и других), а также
моно-аминоксидаз, гистаминазы (диаминооксидаза) и аминотрансферазы ГАМК, обезвреживающих
(окисляющих) биогенные амины;изомераз
аминокислот,, с помощью которых организм разрушает D-аминокислоты (в состав
тканевых белков млекопитающих входят L-аминокислоты);аминотраисфераз
иодтирозипов и иодтиронинов, участвующих в синтезе гормонощитовидной железы и
распаде этих гормонов в периферических тканях;синтазы
дельта-аминолевуленовой кислоты участвующей в биосинтезе гема гемоглобина и
других гемсодержащих белков (из глицина и сукцинил~КоА);кинурениназы
и кинуренинаминотрансферазы, обеспечивающих синтез витамина РР из триптофана;цистатионинсинтазы
(а) и цистатионинлиазы (б) — ферментов, катализирующих синтез и распад
цистатионина в следующих реакциях:
синтетазы
3-кетодигидросфингозида, участвующей в реакциях биосинтеза сфинголипидов (из
серина и пальмитил-КоА).
Таким образом, витамин В6 характеризуется исключительно широким
спектром биологического действия. Он принимает участие в регуляции белкового,
углеводного и липидного обмена, биосинтезе гемма- и биогенных аминов, гормонов
щитовидной железы и других биологически активных соединений. Помимо
каталитического действия, пиридоксальфосфат участвует в процессе активного
транспорта некоторых аминокислот через клеточные мембраны, ему присуща функция
регулятора конформационного состояния гликогенфосфорилазы — главного
регулируемого фермента, осуществляющего распад гликогена.
Гиповитаминоз
витамина B6. Основными проявлениями недостаточности витамина В6
являются гипохромная анемия и судороги. Отмечается развитие сухого себорейного
дерматита, стоматита и глоссита. Чаще всего пиридоксиновая недостаточность
наблюдается у маленьких детей при искусственном вскармливании стерилизованным
молоком (разрушается витамин В6), у беременных при токсикозах, а
также у взрослых при длительном лечении противотуберкулезным препаратом
изониазидом (антагонист пиридоксаля). Повышенная возбудимость и склонность к
судорогам объясняются недостаточным образованием ГАМК (гамма-аминомасляной
кислоты) — медиатора торможения нейронов. Поражения кожи частично обусловлены
недостаточностью витамина РР, в синтезе которого принимает участие витамин В6.
По данным клинических наблюдений, дефицит пиридоксаля предрасполагает к инфаркту
миокарда.
Какого-либо
выраженного побочного действия при длительном приеме высоких доз витамина (в
10—20 раз превышающих суточную потребность) отмечено не было. Доза 200—5000 мг
может вызвать онемение, покалывание и кратковременную потерю чувствительности в
конечностях.
Наиболее
хорошо изученными энзимопатиями, связанными с дефектом пиридоксальзависимых
ферментов, являются врожденная гомоиистинурия, врожденная цистатионинурия,
наследственная ксантуренурия, пиридоксин-зависимый судорожный синдром и пирилоксинзависимая
анемия.
Наиболее
популярным методом оценки обеспеченности организма витамином В6
является флуориметрическое определение содержания в моче 4-пиридокси-ловой
кислоты — продукта деградации витамина. При гиповитаминозе В6
суточная экскреция 4-пиридоксиловой кислоты снижается (в норме — 3—5 мг).
Однако более точную информацию дает измерение содержания самого витамина
(особенно пиридоксальфосфата) в плазме крови и моче.
Витамином
В6 богаты бобовые, зерновые культуры, мясные продукты, рыба,
картофель. Он синтезируется кишечной микрофлорой, частично покрывая потребность
организма в этом витамине.
В
сутки человек должен получать 2—2,2 мг пиридоксина. Потребность в витамине
возрастает при увеличении количества белка в рационе, а также во время
беременности и лактации. Прием алкоголя и курение уменьшают содержание
пиридоксальфосфата в тканях.
3. Сложные белки гликопротеины и
липопротеины. Функциональная активность, пищевая ценность и распространение в
природе липидов и углеводов.
3.1. Особенности химического строения и функций
гликосфинголипидов
Гликосфинголипиды, липиды общей формулы, где R и R'-алкил или
алкенил (могут содержать гидроксигруппу) с 13-24 атомами
С; Х-остаток углевода.
В
зависимости от структуры X делятся на нейтральные (моно- и
олигогликозилцерамиды), которые содержат в молекуле нейтральные сахара и N-ацетиламиносахара, и кислые (ганглиозиды
и сульфогликозилцерамиды), содержащие в углеводном остатке карбоксильные группы или
остаток серной кислоты.
Название
гликосфинголипидов по правилам ИЮПАК определяется углеводной частью молекулы. Так, соединения формулы I (Y =
Н, в общей формуле Х-остаток ганглиотетраозы) называются
ганглиотетраозилцерамидом и обозначается GgOse4Cer, где
GgOse-олигосахаридная цепь, Сеr-остаток церамида (в общей формуле X = Н); цифра в
нижнем индексе показывает количество остатков моносахаридов в олигосахаридной цепи.
Гликосфинголипиды
– белые твердые веществава.
Умеренно растворимые в органических растворителях. Расщепляются кислотами,
водными растворами щелочей и специфическими ферментами.
Гликосфинголипиды (гликолипиды) широко представлены
в тканях, особенно в нервной ткани, в частности в мозге. Главной формой
гликолипидов в животных тканях являются гликосфинголипиды. Последние содержат
церамид, состоящий из спирта сфингозина и остатка жирной кислоты, и один или
несколько остатков сахаров.
Гликосфинголипиды
широко распространены в животных тканях
[R-обычно СН3(СН2)12СН=СН], меньше – в растениях [R-главным образом СН3(СН2)13СН(ОН)].
Локализованы в основном на поверхности плазматической мембраны,
где выполняют функции антигенов и групповых веществ крови,
входят в состав рецепторов, а также участвуют в регуляции
роста и адгезии клеток
и иммунологических процессов.
Биосинтез
гликосфинголипидов осуществляется в аппарате Гольджи путем переноса моносахаридов главным образом от уридиндифосфатсахаров к церамиду в присутствии специфических гликозилтрансфераз.
При
нарушении метаболизма гликосфинголипидов из-за
отсутствия в лизосоме некоторых гликозидаз возникают болезни
(сфинголипидозы), обусловленные повышенным содержанием в организме
определенных гликосфинголипидов, например при болезни Гоше – глюкозилцерамида,
при болезни Фабри – дигалактозилглюкозилцерамида.
В
препаративных количествах гликосфинголипиды получают из природных источников.
Простейшими гликосфинголипидами являются
галактозилцерамиды и глюкозилцерамиды.
Галактозилцерамиды – главные сфинголипиды мозга и
других нервных тканей, но в небольших количествах встречаются и во многих
других тканях. В состав галактозилцерамидов входит гексоза (обычно это
D-галактоза), которая связана эфирной связью с гидроксильной группой
аминоспирта сфингозина. Кроме того, в составе галактозилцерамида имеется жирная
кислота. Чаще всего это лигноцериновая, нервоновая или це-реброновая кислота,
т.е. жирные кислоты, имеющие 24 углеродных атома.
Более
сложными гликосфинголипидами являются ганглиозиды, образующиеся из
гликозилцерамидов. Ганглиозиды дополнительно содержат одну или несколько
молекул сиаловой кислоты. В тканях человека доминирующей сиаловой кислотой
является нейраминовая. Кроме того, вместо остатка глюкозы они чаще содержат
сложный олигосахарид. Ганглиозиды в больших количествах находятся в нервной
ткани. Они, по-видимому, выполняют рецепторные и другие функции. Одним из
простейших ганглиозидов является гематозид, выделенный из стромы эритроцитов.
Он содержит церамид (ацилсфингозин), одну молекулу глюкозы, одну молекулу N-ацетилнейраминовой
кислоты.
4. Структура
и свойства белковых молекул.
4.1. Покажите механизм образования связей между
протомерами при формировании четвертичной структуры белковой молекулы на
примере гемоглобина или другой молекулы
В
белках различают первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры:
Под
четвертичной структурой подразумевают способ укладки в пространстве отдельных
полипептидных цепей, обладающих одинаковой (или разной) первичной, вторичной
или третичной структурой, и формирование единого в структурном и функциональном
отношениях макромолекулярного образования.
Многие
функциональные белки состоят из нескольких полипептидных
цепей, соединенных не главновалентными связями, а нековалентными (аналогичными
тем, которые обеспечивают стабильность третичной структуры). Каждая отдельно
взятая полипептидная цепь, получившая название протомера, мономера или субъединицы, чаще всего не
обладает биологической активностью.
Эту
способность белок приобретает при определенном способе
пространственного объединения входящих в его состав протомеров, т.е. возникает
новое качество, не свойственное мономерному белку.
Образовавшуюся молекулу принято называть олигомером (или мультимером).
Олигомерные
белки чаще построены из четного числа
протомеров (от 2 до 4, реже от 6 до 8) с одинаковыми или разными молекулярными массами – от нескольких
тысяч до сотен тысяч. В частности, молекула гемоглобина
состоит из двух одинаковых ?- и двух ?-полипептидных цепей, т.е. представляет
собой тетрамер. На рисунке 4.1
представлена структура молекулы гемоглобина,
а на рис. 4.2 хорошо видно, что молекула гемоглобина
содержит четыре полипептидные цепи, каждая из которых окружает группу гема
– пигмента, придающего крови
ее характерный красный цвет.
В
определенных условиях (присутствие солей, 8М мочевины или резкие изменения рН) молекула гемоглобина
обратимо диссоциирует на две ?-и две ?-цепи. Эта диссоциация обусловлена разрывом водородных связей. После
удаления солей или мочевины происходит автоматическая
ассоциация исходной молекулы гемоглобина
(рисунок 4.3).
Рисунок 4.1 - Олигомерная молекула гемоглобина (красные диски
– группы гема)
Рисунок 4.2 - Модель гемоглобина (по Перутцу): ?-Цепи
светлые; ?-цепи темные; группы гема – красные.
Классическим
примером олигомерной молекулы, или надмолекулярной структуры,
является вирус табачной мозаики, представляющий
собой гигантскую молекулу с мол. м. около 40•106.
Он состоит из одной молекулы РНК
и 2130 белковых субъединиц, масса каждой из которых составляет 17500.
Длина вируса
примерно 300 нм, ширина – около 17 нм. РНК
вируса имеет спиралеобразную форму. Вокруг
РНК нанизаны белковые частицы, образующие
гигантскую надмолекулярную спиральную структуру, в которой насчитывается около
130 витков.
Удивительной
особенностью вируса является то, что после разъединения
соответствующими приемами (добавление детергента) РНК
и белковых субъединиц и последующего их смешивания (с предварительным удалением
детергента) наблюдаются полная регенерация
четвертичной структуры, восстановление всех физических параметров
и биологических функций (инфективная способность вируса).
Подобная точность процесса спонтанной самосборки вируса
обеспечивается, вероятнее всего, информацией, содержащейся в первичной
структуре молекулы РНК
и белковых субъединиц.
Таким
образом, последовательность аминокислот содержит в себе информацию,
которая реализуется на всех уровнях структурной
организации белков.
Многие
ферменты также обладают четвертичной
структурой, например фосфорилаза а,
состоящая из двух идентичных субъединиц, в каждой из которых по две пептидные
цепи. Вся молекула фосфорилазы а, таким образом, представляет собой тетрамер. Отдельные
субъединицы чаще всего не обладают каталитической активностью;
вообще регуляторные ферменты имеют четвертичную олигомерную
структуру. Они наделены функцией обеспечения в клетке
требуемых скоростей
химических реакций.
Наиболее
изученным олигомерным ферментом является лактатдегидрогеназа
(она катализирует обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную),
содержащая два типа полипептидных цепей: Н – сердечный тип (от англ. heart – сердце)
и М – мышечный тип (от англ. muscle – мышца) – и состоящая из 4 субъединиц.
Этот фермент благодаря различным сочетаниям
субъединиц может существовать в 5 формах. Такие ферменты получили название изоферментов, или, в соответствии с новой классификацией, множественных форм ферментов.
Рисунок 4.3 - Обратимая диссоциация молекулы гемоглобина.
Рисунок 4.4 - Самосборка вируса
табачной мозаики
К
настоящему времени субъединичная структура обнаружена у нескольких сотен белков.
Однако только для немногих белков, в том числе для молекулы гемоглобина,
методом рентгеноструктурного анализа расшифрована четвертичная структура.
Основными
силами, стабилизирующими четвертичную структуру, являются нековалентные связи
между контактными площадками протомеров, которые взаимодействуют друг с другом
по типу комплементарности – универсальному
принципу, свойственному живой природе. Структура белка
после его синтеза в рибосоме может частично подвергаться
модификации (посттрансляционный процессинг):
например, при превращении предшественников ряда ферментов или гормонов (инсулин).
Таким
образом, имеются все основания
для подтверждения мнения о существовании 4 уровней структурной
организации белков. Более того, каждый индивидуальный белок
характеризуется уникальной структурой, обеспечивающей уникальность его функций.
Поэтому выяснение структуры разнообразных белков
может служить ключом к познанию природы живых систем и соответственно сущности
жизни. На этом пути научного поиска могут быть решены также многие проблемы наследственных
заболеваний человека, в основе которых лежат дефекты структуры и биосинтеза
белков.
Протомеры
связаны друг с другом посредством лишь нековалентных связей (ионных,
водородных, гидрофобных). Причем протомеры взаимодействуют друг с другом только
определенными участками своей поверхности (контактные участки). Взаимное «узнавание»
контактных участков происходит по принципу комплементарности. Каждый протомер
взаимодействует с другим во многих точках. Следовательно, ошибочные комплексы в
олигомере практически невозможны.
Олигомерные
белки способны взаимодействовать с несколькими лигандами в центрах, удаленных
друг от друга. Связывание одного протомера с лигандом изменяет конформацию
этого протомера, а также всего олигомера и, кроме того, сродство к другим
лигандам.
Таким
образом, функциональная активность олигомерных белков может регулироваться
аллостерическими лигандами. Связь между структурой белка и его функцией можно
рассмотреть на примере двух родственных белков: миоглобина и гемоглобина.
Миоглобин - мономер (состоит из одной полипептидной цепи), основная его функция
- запасание кислорода в тканях. Имея высокое сродство к кислороду, миоглобин
легко присоединяет его и отдает кислород только при интенсивной мышечной
работе, когда парциальное давление кислорода падает ниже 10 мм рт. ст. Гемоглобин -
тетрамер (состоит из четырех протомеров). Основная функция гемоглобина -
обратимое связывание с кислородом в легких, где парциальное давление кислорода
высокое и гемоглобин взаимодействует с четырьмя молекулами кислорода.
Некоторые
исследователи склонны рассматривать, и не без основания, существование
пятого уровня структурной организации белков. Речь идет о
полифункциональных макромолекулярных комплексах, или ассоциатах из разных ферментов, получивших название
метаболических олигомеров, или метаболонов, и
катализирующих весь путь превращений субстрата
(синтетазы высших жирных кислот,
пируватдегидрогеназный комплекс, дыхательная цепь).
5. Аминокислотный
состав белков, пептиды.
5.1. Напишите химическую формулу пентапептида:
изолейцил – фенилаланил – треонил – аргинил – метионин. Покажите механизм
образования пептидной связи. Дайте определение первичной структуре белка
Протеиногенные аминокислоты
Название
аминокислоты и ее радикала
Структурная формула
Обозначение
Изолейцин
(изолейцил)
Ile / I
Треонин (треонил)
Thr / T
Метионин (метионил)
Met / M
Аргинин (аргинил)
Arg / R
Фенилаланин (фенилаланил)
Phe / F
Главными
структурными единицами белкой и пептидов являются остатки аминокислот,
связанные карбоксамидной пептидной связью между ?-карбоксильной и
?-аминогруппой. Продуктом конденсации карбоновых кислот и первичных аминов
являются амиды карбоновых кислот (R-NH-СО—R'). Поскольку остатки аминокислот в
пептидах и белках связаны амидной связью, этот тип связи носит название
пептидной.
К
настоящему времени расшифрована первичная структура десятков тысяч разных белков,
что является несомненным достижением биохимии.
Однако это число ничтожно мало, если учесть, что в природе около 1012
разнообразных белков.
Под
первичной структурой подразумевают порядок, последовательность расположения
аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Зная первичную структуру, местоположение
каждого остатка аминокислоты, можно точно написать структурную формулу
белковой молекулы, если она представлена одной
полипептидной цепью.
Если в
состав белка входит несколько полипептидных
цепей, объединенных в одну белковую молекулу посредством дисульфидных
связей и нековалент-ных взаимодействий, или если одна полипептидная
цепь содержит внутренние дисульфидные связи, то задача определения
первичной структуры несколько осложняется, так как необходимо предварительное
разъединение этих цепей и связей. Разъединение таких полипептидных цепей
производят с помощью денатурирующих агентов (растворы 8М мочевины или 6М гуанидингидрохлорида),
разрывающих нековалентные связи.
Дисульфидные
связи разрушают путем окисления или восстановления
(надмуравьиной кислотой
или ?-меркаптоэтанолом соответственно), при этом образуются свободные полипептиды, содержащие или остатки
цистеиновой кислоты,
или цистеина:
Для
определения первичной структуры отдельной, химически гомогенной полипептидной
цепи в первую очередь методами гидролиза выясняют аминокислотный состав,
точнее, соотношение каждой из 20 аминокислот
в образце гомогенного полипептида. Затем приступают к
определению химической природы концевых аминокислот
полипептидной цепи, содержащей одну свободную NH2-группу и одну
свободную СООН-группу.
Определение
первичной структуры белков сводится к выяснению порядка расположения
аминокислот в полипептидной цепочке. Эту задачу решают с помощью метода
секвенирования (от англ. sequence последовательность).
Собственно
секвенирование на его сегодняшнем уровне позволяет определить аминокислотную
последовательность а полипептидах, размер которых не превышает несколько
десятков аминокислотных остатков. В то же время исследуемые полипептидные
фрагменты значительно короче тех природных белков, с которыми приходится иметь
дело. Поэтому необходимо предварительное разрезание исходного полипептида на
короткие фрагменты. После секвенирования полученных фрагментов их необходимо
снова сшить в первоначальной последовательности.
Таким
образом определение первичной последовательности белка сводится к следующим
основным этапам:
Расщепление
белка на несколько фрагментов длиной, доступной для секвенирования.Секвенирование
каждого из полученных фрагментов.Сборка
полной структуры белка из установленных структур его фрагментов.
Для
специфического расщепления белков по определенным точкам применяются как
ферментативные, так и химические методы.
Из
ферментов, катализирующих гидролиз белков по определенным точкам, наиболее
широко используют трипсин
и химотрипсин. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, расположенных
после остатков лизина и аргинина. Химотрипсин преимущественно расщепляет белки
после остатков ароматических аминокислот - фенилаланина, тирозина и триптофана.
При необходимости специфичность трипсина может быть повышена или изменена.
Например, обработка цитраконовым ангидридом исследуемого белка приводит к
ацилированию остатков лизина. В таком модифицированном белке расщепление будет
проходить только по остаткам аргинина.
Наряду
с ферментативными методами используются и химические методы расщепления белков.
Для этой цели часто применяют бромциан, расщепляющий белок по остаткам
метионина:
Секвенирование
проводят методом, известным как метод Эдмана. Последовательная обработка
полипептида, имеющего свободную концевую -аминогруппу, каким-либо алкил- или арилизотиоцианатом
в слабощелочной среде приводит к образованию соответствующей тиомочевины,
которая в умеренно кислой среде приводит (при значениях кислотности, не
повреждающих пептидной связи) отщепляется в виде соответствующего
тиогидантоина. Оригинальная процедура Эдмана основана на использовании
фенилизотиоцианата и тем самым на образовании фенилтиогидантоинов:
В
результате образуется фенилтиогидантоин, содержащий боковой радикал
аминокислоты R1, который может быть идентифицирован путем измерения какой-либо
физической или физико-химической характеристики, позволяющей различать
гидантоины, соответствующие разным входящим в состав белков аминокислотам. В
качестве такой характеристики может служить хроматографическая подвижность в
какой-либо предварительно проградуированной по стандартным образцам гидантоинов
системе или молекулярная масса, определяемая с помощью масс-спектрометра.
Превращение
N-концевого аминокислотного остатка в тиогидантоин приводит к укорочению
анализируемой полипептидной цепи на одно звено. Выделив этот пептид,
исследователь получает возможность повторить всю процедуру, установить природу
второго аминокислотного остатка и выделить полипептид, укороченный на два
звена. Многократное повторение такой ступенчатой деградации дает возможность
последовательно идентифицировать все составляющие исходный полипептид остатки
аминокислот, т.е. установить его первичную структуру. Практически метод Эдмана
позволяет сделать один-два десятка шагов. Работа сводится к многократному
повторению одних и тех же чередующихся процедур: добавления изотиоцианата,
отщепления тиогидантоина, отделения его от укороченного пептида для последующей
идентификации, выделение оставшегося полипептида в виде пригодном для
следующего шага обработки. Чтобы избавить исследователей от такой монотонной
работы, требующей вместе с тем строгого соблюдения условий эксперимента на
каждом шаге, созданы специальные автоматизированные установки для проведения всех
перечисленных операций - автоматические секвенаторы полипептидов. С их помощью
удается произвести до 40-60 шагов ступенчатой деградации.
Завершающим
этапом установления первичной структуры белка является восстановление порядка,
в котором просеквенированные фрагменты располагались в исходном полипептиде.
Чаще всего для этой цели используют подход изветный как метод перекрывающихся
белков. Ниже излагается основная идея метода.
Если
установлена структура всех полипептидов, полученных расщеплением исследуемого
белка с помощью трипсина (далее такие полипептиды обозначаются буквой Т от
слова «трипсиновые»), то остается определить для каждого из этих пептидов, с
какими двумя Т-пептидами он соседствует с N- и С-конца. В структуре
просеквенированных Т-пептидов такая информация полностью отсутствует. Однако ее
можно частично, а в ряде случаев и полностью восстановить, если располагать
аналогичными данными для серии полипептидов, полученных расщеплением того же
исследуемого белка по какой-либо другой группе аминокислотных остатков. Для
определенности ниже речь будет идти о полипептидах, полученных расщеплением
химотрипсином (пептиды группы С, chymotryptic).
Как
видно из рисунка, если два Т-пептида являются соседними в исходной цепи, то
существует С-пептид, который либо содержит в своем составе полностью оба или
один из рассматриваемых Т-пептидов, либо как минимум содержит С-концевую часть
левого и N-концевую часть правого пептида группы Т. этот С-пептид перекрывает
два соседних Т-пептида, с чем и связано название метода.
Таким
образом, просматривая структуры пептидов Т и С, можно для любой пары Т-пептидов
выявить, являются ли они соседями в исследуемом белке или разделены одним или
несколькими другими Т-пептидами. Неоднозначность может появиться только в том
случае, если перекрываемый каким-либо из С-петидов концевой фрагмент
встречается у двух или нескольких Т-пептидов. Вероятность этого как правило
невелика. Если это все же происходит, то применяют более сложные методы
комбинаторики.
6. Обмен
веществ.
6.1. Рассчитайте энергетическую эффективность
окисления ацетил ~ SKoA при
согласованной работе ферментов цикла Кребса и дыхательных цепей и выразите в
количестве синтезированных молекул АТФ. Представьте схему.
Цикл трикарбоновых кислот (цикл лимонной кислоты, цикл
Кребса). Это
циклическая последовательность ферментативных реакций, в которой участвуют ди-
и трикарбоновые кислоты, являющиеся промежуточными продуктами при распаде
белков, жиров и углеводов у животных, растений и микробов. Таким образом, цикл
трикарбоновых кислот – конечный (терминальный) общий путь окисления белков,
липидов и углеводов. Он происходит в митохондриях. Открыт в 1937 г. Х. Кребсом и У.
Джонсоном.
Цикл трикарбоновых кислот поставляет вещества для различных
биосинтезов. Он осуществляется в аэробных условиях. Лимитирующей стадией цикла
является синтез янтарной кислоты (сукцината).
Первая стадия
цикла представляет собой альдольную конденсацию щавелевоуксусной (кетоянтарной)
кислоты с ацетилкоферментом А и последующий гидролиз тиоэфирной связи С~S.
Суммарное уравнение цикла трикарбоновых кислот:
СН3СО~SСоА + 3НАД+ + ФАД + ГДФ +
Н3РО4 + 2Н2О > 2СО2 + 3НАДН + 2Н+
+ ФАДН2 + ГТФ + НSСоА.
Г. Кребс первым постулировал значение данного
цикла для полного сгорания пирувата, главным источником которого является
гликолитическое превращение углеводов. В дальнейшем было показано, что
цикл трикарбо-новых кислот
является тем центром, в котором сходятся практически все метаболические пути.
Таким образом, цикл Кребса – общий конечный путь окисления ацетильных
групп (в виде ацетил-КоА), в которые превращается в процессе катаболизма большая часть органических молекул, играющих роль «клеточного топлива«: углеводов, жирных кислот
и аминокислот.
Образовавшийся в результате окислительного декарбоксилирования пирувата в митохондриях
ацетил-КоА вступает в цикл Кребса.
Данный цикл происходит в матриксе митохондрий
и состоит из восьми последовательных
реакций.
Начинается цикл с присоединения ацетил-КоА к оксалоацетату и
образования лимонной кислоты (цитрата). Затем лимонная кислота (шестиуглеродное
соединение) путем ряда дегидрирований (отнятие водорода)
и двух декарбоксилирований (отщепление СО2)
теряет два углеродных атома и снова в цикле Кребса превращается в оксалоацетат
(четырехуглеродное соединение), т.е. в результате полного оборота цикла одна молекула ацетил-КоА сгорает до СО2
и Н2О, а молекула оксалоацетата регенерируется.
Рассмотрим все восемь последовательных
реакций (этапов) цикла Кребса.
Цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса).
Первая реакция
катализируется ферментом цитрат-синтазой, при этом ацетильная
группа ацетил-КоА конденсируется с оксалоацетатом, в результате чего образуется
лимонная кислота:
По-видимому, в данной реакции в качестве
промежуточного продукта образуется связанный с ферментом цитрил-КоА. Затем последний
самопроизвольно и необратимо гидролизуется с образованием цитрата и HS-KoA.
В результате второй реакции образовавшаяся лимонная кислота подвергается
дегидратированию с образованием цисаконитовой кислоты, которая,
присоединяя молекулу воды,
переходит в изолимонную
кислоту (изоцитрат). Катализирует эти обратимые реакции
гидратации–дегидратации фермент аконитатгидратаза (аконитаза). В
результате происходит взаимоперемещение Н и ОН в молекуле цитрата:
Третья реакция,
по-видимому, лимитирует скорость цикла Кребса. Изолимонная кислота
дегидрируется в присутствии НАД-зависимой изо-цитратдегидрогеназы.
В ходе изоцитратдегидрогеназной реакции изолимонная кислота
одновременно декарбоксилируется. НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа является
аллостерическим ферментом, которому в качестве специфического
активатора необходим АДФ.
Кроме того, фермент для проявления своей активности
нуждается в ионах Mg2+ или Мn2+.
Во время четвертой реакции происходит окислительное декарбокси-лирование
?-кетоглутаровой кислоты
с образованием высокоэнергетического соединения сукцинил-КоА. Механизм этой реакции сходен с таковым реакции окислительного декарбоксилирования пирувата до
ацетил-КоА, ?-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс напоминает по своей
структуре пируватдегидрогеназный комплекс. Как в одном, так и в другом случае в
реакции принимают участие
5 коферментов: ТПФ, амид липоевой кислоты, HS-KoA, ФАД и НАД+.
Пятая реакция
катализируется ферментом сукцинил-КоА-синтета-зой. В ходе
этой реакции
сукцинил-КоА при участии ГТФ и неорганического фосфата превращается в янтарную кислоту (сукцинат). Одновременно происходит
образование высокоэргической фосфатной связи ГТФ за счет высокоэргической
тиоэфирной связи сукцинил-КоА:
В результате шестой реакции сукцинат дегидрируется в фумаровую кислоту. Окисление сукцината катализируется сукцинатдегидрогеназой, в молекуле которой с белком
прочно (ковалентно) связан кофермент ФАД. В свою очередь сукцинатдегидрогеназа прочно связана с
внутренней ми-тохондриальной мембраной:
Седьмая реакция осуществляется под влиянием фермента фума-ратгидратазы (фумаразы). Образовавшаяся при этом фумаровая кислота гидратируется, продуктом
реакции является яблочная кислота (малат). Следует
отметить, что фумаратгидратаза обладает стереоспецифичностью – в ходе реакции образуется
L-яблочная кислота:
Наконец, в ходе восьмой реакции цикла трикарбоновых кислот под влиянием
митохондриальной НАД-зависимой малатдегидрогеназы
происходит окисление L-малата в оксалоацетат:
Как видно, за один оборот цикла, состоящего из восьми
ферментативных реакций,
происходит полное окисление («сгорание») одной молекулы ацетил-КоА. Для непрерывной
работы цикла необходимо постоянное поступление в систему ацетил-КоА, а коферменты (НАД+ и ФАД),
перешедшие в восстановленное состояние, должны снова и снова окисляться. Это окисление осуществляется в системе
переносчиков электронов в дыхательной
цепи (в цепи дыхательных ферментов), локализованной в мембране
митохондрий. Образовавшийся ФАДН2
прочно связан с СДГ, поэтому он передает атомы
водорода через KoQ.
Освобождающаяся в результате окисления ацетил-КоА энергия в
значительной мере сосредоточивается в макроэргических фосфатных связях АТФ.
Из 4 пар атомов
водорода 3 пары переносят НАДН на систему транспорта электронов; при этом в расчете на каждую пару в системе биологического окисления образуется 3 молекулы АТФ
(в процессе сопряженного окислительного фосфорилирования), а всего,
следовательно, 9 молекул АТФ.
Одна пара атомов
от сукцинатдегидрогеназы-ФАДН2 попадает в систему транспорта электронов через KoQ, в результате
образуется только 2 молекулы АТФ.
В ходе цикла Кребса синтезируется также одна молекула ГТФ (субстратное фосфорилирование), что равносильно одной молекуле АТФ.
Итак, при окислении одной молекулы ацетил-КоА в цикле Кребса и системе окислительного фосфорилирования может
образоваться 12 молекул АТФ.
Если подсчитать полный энергетический эффект гликолитического
расщепления глюкозы и последующего окисления двух образовавшихся молекул пирувата до СО2 и Н2О,
то он окажется значительно большим.
Как отмечалось, одна молекула НАДН (3 молекулы АТФ)
образуется при окислительном декарбоксилировании пирувата в ацетил-КоА.
При расщеплении одной молекулы глюкозы образуется 2 молекулы пирувата, а при окислении их до 2 молекул ацетил-КоА и последующих 2
оборотов цикла трикарбоновых кислот синтезируется
30 молекул АТФ
(следовательно, окисление молекулы пирувата до СО2 и Н2О
дает 15 молекул АТФ).
К этому количеству надо добавить 2 молекулы АТФ,
образующиеся при аэробном гликолизе, и 6 молекул АТФ,
синтезирующихся за счет окисления 2 молекул внемитохондриального НАДН, которые
образуются при окислении 2 молекул глицеральдегид-3-фосфата в
дегидрогеназной реакции
гликолиза.
Следовательно, при расщеплении в тканях
одной молекулы глюкозы по уравнению
С6Н12О6 + 6О2 >
6СО2 + 6Н2О синтезируется 38 молекул АТФ.
Несомненно, что в энергетическом отношении полное расщепление глюкозы является более эффективным
процессом, чем анаэробный гликолиз.
Необходимо отметить, что образовавшиеся в процессе
превращения глицеральдегид-3-фосфата 2 молекулы НАДН в дальнейшем при окислении могут давать не 6 молекул АТФ,
а только 4. Дело в том, что сами молекулы внемитохондриального НАДН не
способны проникать через мембрану внутрь митохондрий.
Однако отдаваемые ими электроны могут включаться в
митохондриальную цепь биологического окисления с помощью так называемого
глицеролфосфатного челночного механизма.
Цитоплазматический НАДН сначала реагирует с цитоплазматическим
дигидроксиацетонфосфатом, образуя глицерол-3-фосфат. Реакция катализируется
НАД-зависимой цитоплазматической глицерол-3-фосфат-дегидроге-назой:
Дигидроксиацетонфосфат + НАДН + Н+ -
Глицерол-3-фосфат + НАД+.
Глицеролфосфатный челночный механизм.
Образовавшийся глицерол-3-фосфат легко проникает через
митохонд-риальную мембрану. Внутри митохондрии
другая (митохондриальная) глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа (флавиновый фермент) снова окисляет глицерол-3-фосфат
до диоксиацетонфосфата:
Глицерол-3-фосфат + ФАД - Диоксиацетонфосфат + ФАДН2.
Восстановленный флавопротеин
(фермент-ФАДН2) вводит на уровне KoQ приобретенные им электроны в цепь биологического окисления и сопряженного с ним окислительного фосфорилирования, а
диоксиацетонфосфат выходит из митохондрий
в цитоплазму и может вновь взаимодействовать
с цитоплазматическим НАДН + Н+.
Таким образом, пара электронов (из одной молекулы цитоплазматического НАДН + Н+),
вводимая в дыхательную цепь с помощью глицеролфосфатного
челночного механизма, дает не 3, а 2 АТФ.
Малат-аспартатная челночная система для переноса
восстанавливающих эквивалентов от цитозольного НАДН в митохондриальный матрикс
В дальнейшем было показано, что с помощью данного челночного
механизма лишь в скелетных мышцах и мозге осуществляется перенос
восстановленных эквивалентов от цитозольного НАДН + Н+ в митохондрии.
В клетках печени,
почек и сердца действует более сложная малатаспартатная челночная система.
Действие такого челночного механизма становится возможным благодаря присутствию
малатдегидрогеназы и ас-партатаминотрансферазы
как в цитозоле, так и в митохондриях.
Установлено, что от цитозольного НАДН + Н+
восстановленные эквиваленты сначала при участии фермента малатдегидрогеназы
переносятся на цитозольный оксалоацетат. В результате образуется малат, который
с помощью системы, транспортирующей дикарбоновые кислоты, проходит через
внутреннюю мембрану митохондрии
в матрикс. Здесь малат окисляется в оксалоацетат, а матриксный НАД+
восстанавливается в НАДН + Н+, который может теперь передавать свои электроны в цепь
дыхательных ферментов, локализованную на внутренней мембране
митохондрии. В свою очередь образовавшийся
оксалоацетат в присутствии глутамата и фермента АсАТ вступает в реакцию трансаминирования. Образующиеся аспарат и
?-кетоглутарат с помощью специальных транспортных систем способны проходить
через мембрану митохондрий.
Транспортирование в цитозоле регенерирует оксалоацетат, что
вызывает к действию следующий цикл. В целом процесс включает легкообратимые реакции, происходит без
потребления энергии, «движущей силой» его является постоянное восстановление
НАД+ в цитозоле гли-церальдегид-3-фосфатом, образующимся при катаболизме глюкозы.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ
СПИСОК
Биохимия
[Текст]: учеб. для вузов по направлениям 655700 «Технология продовольств.
продуктов специального назначения о обществ. питания», 655600 «Пр-во продуктов
питания из растит. сырья» / В. Г. Щербаков и др.; под ред. В. Г. Щербакова. – СПб.:
ГИОРД, 2009. – 466 с.: ил.Кольман,
Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К.-Г. Рём; Пер. с нем. Л. В. Козлова и др.;
Под ред. П. Д. Решетова, Т. И. Соркиной. – М.: Мир, 2000. – 469 с.: ил.Комов,
В. П. Биохимия [Текст]: учеб. для вузов по направлению 655500 - Биотехнология /
В. П. Комов, В. Н. Шведова. – М.: Дрофа, 2006. – 638 с.: ил.Коничев,
А. С. Биохимия и молекулярная биология [Текст]: словарь терминов / А. С.
Коничев, Г. А. Севастьянова. – М.: Дрофа, 2008. – 359 с.: ил.Кунижев,
С. М. Краткий словарь биохимических терминов / С. М. Кунижев, Е. В. Денисова,
С. Ф. Андрусенко. – М.: Вузовская книга, 2005. – 85 с.: ил.Пищевая
химия: учеб. для вузов по направлениям 552400 «Технология продуктов питания» и
др. / А. П. Нечаев, С. Е. Траубенберг, А. А. Кочеткова и др.; под ред. А. П.
Нечаева. – СПб.: ГИОРД, 2007. – 636 с.: ил.Рогов,
И. А. Химия пищи [Текст]: учебник для вузов по направлению «Технология сырья и
продуктов животного происхождения», специальностям 260301 «Технология мяса и
мясных продуктов» и др. / И. А. Рогов, Л. В. Антипова, Н. И. Дунченко. – М.: КолосС,
2007. – 852 с.: ил.Румянцев,
Е. В. Химические основы жизни [Текст]: учеб. пособие для вузов по направлению
подготовки бакалавров и магистров «Химия» / Е. В. Румянцев, Е. В. Антина, Ю. В.
Чистяков. – М.: Химия: КолосС, 2007. – 558 с. Спиричев,
В. Б. Витамины, витаминоподобные и минеральные вещества: Справ. / В. Б.
Спиричев. – М.: МЦФЭР, 2004. – 231 с.