Полный текст:
Термин фторацетат (ФА) относится к большому ряду химических соединений с общей формулой СН2FCOOR. ФА и некоторые другие монофтористые соединения относятся к высокотоксичным веществам, характерным признаком действия которых является латентный период, составляющий для человека от получаса до нескольких часов, даже при отравлении летальными дозами. Натриевая соль ФА, известная под названием “вещество 1080”, используется во многих странах для контроля численности популяций некоторых видов позвоночных и для борьбы с грызунами (в США ФА был запрещен как родентицид в 1972 г.). ФА сначала был синтезирован в 1896 г., и лишь спустя много лет был обнаружен в некоторых растениях, произрастающих в Австралии, на юге Африки и в Южной Америке. Уровень ФА в некоторых австралийских растениях достигает 5 г/кг сухого веса и при однократном или повторном употреблении жвачными животными служит причиной их гибели, причиняя порой ощутимый экономический ущерб. В последнее время существует проблема химической безопасности, связанная с возможностью использования ФА террористами. Простота получения, высокая растворимость в воде, отсутствие вкусовых ощущений, отсроченные проявления токсичности и схожесть клинических признаков интоксикации с рядом естественных недомоганий заставляет по-новому оценить потенциальную опасность ФА и вести поиск эффективных средств терапии.
Развитие промышленности привело к тому, что ФА можно обнаружить в составе дождя и тумана. Химически чистый ФА - устойчивое соединение, а энергия диссоциации фтор-углеродной связи в молекуле ФА считается одной из наиболее высоких среди природных веществ. В то же время в биологических образцах растений происходит разложение ФА: так, через 14 дней хранения образцов дихапеталум цимозный (гифблаар) Dichapetalum cymosum при комнатной температуре в них остается лишь 50% ФА.
Высокая токсичность ФА практически не зависит от пути поступления в организм. ФА хорошо абсорбируется тканями при ингаляционном и оральном путях поступления в организм. Анализ данных по токсикокинетике свидетельствует о том, что ФА в организме распределяется почти равномерно по органам и тканям, с некоторым преимущественным накоплением в сердце, мозге и почках. Механизм токсического действия ФА широко известен под названием “летальный синтез”, суть которого заключается в превращении в клетках организма нетоксичного самого по себе ФА в токсичный фторцитрат. Фторцитрат может ингибировать транспорт цитрата из митохондрий, подавлять активность сукцинатдегидрогеназы и фосфофруктокиназы. И все же главными причинами гибели организма считаются внутриклеточный дисбаланс ионов, осмотический дисбаланс и дефицит АТФ вследствие блокады аконитазы. В результате происходит накопление цитрата в тканях и плазме организма, истощение энергетических запасов и наступает смерть. Латентный период с момента введения ФА в организм до появления признаков отравления составляет от 30 мин. до 3 часов (у теплокровных животных). Это время, необходимое для проникновения ФА в кровь, в клетки, конверсии ФА во фторцитрат с последующим разобщением клеточных процессов. Смерть обычно наступает в течение 24-48 часов, но может наступить и позже
Детоксикация ФА происходит главным образом в печени. Отмечена зависимость токсичности ФА от температуры окружающей среды: с ростом температуры повышается токсичность. В отсутствие специфических клинических, физиологических и морфологических признаков интоксикации диагностическим подтверждением отравления ФА может служить определение самого вещества в тканях, наряду с уровнем цитрата и фтора.
Также следует указать на ряд соединений, метаболизм которых в организме протекает с образованием в качестве промежуточного продукта ФА. Это некоторые противоопухолевые препараты, наркотические анальгетики (нормеперидин и норметазоцин), пестициды (1,3-дифтор–2-пропанол и фторацетамид), 1-(ди)гало-2-фторэтаны и фторэтанол. Наконец, укажем на принципиальную возможность использования самого ФА в позитивных целях: фторацетат натрия оказался довольно сильным радиопротектором в силу своей способности снижать потребление кислорода и температуру тела.
Материалы и методы
Исходя из того, что к поражению фторацетатом наиболее чувствительны сердце, мозг и почки, для культивирования нами были выбраны клетки именно этих объектов-кардиомиоциты, нейроны эндотелий аорты.
Для выделения клеток эндотелия аорты использовались крысы линии Wistar массой 200-250 грамм. Крысу декапитировали, извлекали грудной участок аорты и помещали в чашку Петри с холодным HBSS. Все дальнейшие процедуры проводили в ламинарном боксе в стерильных условиях. Отделяли аорту от сопутствующих органов и помещали в чистую чашку Петри с холодным HBSS. Аорту отмывали несколько раз от крови, после чего, острыми пинцетами удаляли жировую и соеденительную ткани окружаюшие аорту. Далее, аорта помещалась в чистую чашку Петри с небольшим колличеством HBSS и с помошью хирургического скальпеля разрезалась на кольца (экспланты) толщиной 1 мм. Кольца помещались в лунки 24х луночного культурального планшета (1-2 экспланта на лунку) покрытого 0,2% желатином или коллагеновым гелем с небольшим колличеством DMEM с 4мМ л-глутамина и 20% эмбриональной сыворотки телят. Через несколько дней, когда в просвете эксплантов были заметны мигрирующие клетки эндотелия, экспланты удалялись, а клетки доращивались до монослоя. Клетки пересевали в отношении 1:3 с использованием раствора трипсин-ЭДТА.Все эксперименты проводились на клетках между пассажами 3 и 6. За двое суток до эксперимента клетки эндотелия пересаживали в чашку Петри диаметром 3,5 мм покрытую 0,001% поли-л-лизина в концетрации 5*105 клеток в мл.
Выделение кардиомиоцитов.
Кардиомиоциты выделяли из крыс линии Wistar массой 150-180 грамм. В результате выделения получали 85-90% жизнеспособных кальцийтолерантных клеток прямоугольной формы. Суспензию кардиомиоцитов помещали в чашку Петри покрытую коллагеном и через 60 минут смывали неприкрепившиеся клетки. Прикрепившиеся клетки использовали для экспериментов.
Измерение цитозольного кальция ([Ca2+]i) и митохондриального потенциала (DY-m) методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.
Для измерения [Ca2+]i клетки эндотелия и кардиомиоциты инкубировали 40 минут при 370С с 5мкМ Fluo4-AM и 0.005% Pluronic в HBSS. Для одновременного измерения [Ca2+]i и DY-m в последние 15 минут инкубации к клеткам добавляли 20 нМ TMRM - флуоресцентный зонд на DY-m. Все последующие растворы содержали 20 нМ TMRM. После этого, клетки 3 раза отмывали HBSS и чашку Петри помещали на предметный столик лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM 510 Carl Zeiss. Рабочий объем составлял 1,5 мл. Измерения проводили с помощью воздушноиммерсионного обьектива Zeiss PlanNeofluar х20 и водоиммерсионного обьектива Zeiss PlanNeofluar х63. Для возбуждения флуоресценции Fluo4 использовали аргоновый лазер с длинной волны 488 нм и регистрировали флуоресценцию с использованием запирающего фильтра BP500-550 нм. Для регистрации изменений митохондриального потенциала флуоресценцию TMRM возбуждали с использованием гелий/неонового лазера 543 нм и регистрировали с использованием пропускающего фильтра LP560 нм. Обработку и анализ изображения проводили с использованием программ Kinetic Imaging software (Liverpool, UK) и OriginPro 7.0.
Рис 1. Изменение мембранного потенциала митохондрий в клетках эндотелия в культуре в ответ на добавление олигомицина и FCCCP. Уменьшение потенциала соответствует уменьшению флуоресценции.
Измерение МП проводили с помощью флуоресцентного зонда TMRM и используя его в низких концентрациях, когда накопление зонда в МХ при росте потенциала сопровождается ростом флуоресценции. На рисунке 1 показан контрольный эксперимент – изменение МП при добавлении ингибитора Н+-АТР-азы (окислительного фосфорилирования) олигомицина (1мкг/мл) и протонофора FCCP (1 мкМ). Приведена одновременна запись с трех клеток в поле зрения конфокального микроскопа. Показано, что ингибирование окислительного фосфорилирования (ОФ) приводит к росту МП, а разобщение МХ, к падению МП. Такие же изменения МП наблюдаются и на изолированных МХ в присутствии ADP.
ФА вызывает рост [Са2+]i и рост МП митохондрий в кардиомиоцитах.
Рис 2А. изменения концентрации Са2+ в цитозоле в четырех кардиомиоцитах в ответ на добавление 10 мМ ФА.
Рис 2В. изменения МП митохондрий в четырех кардиомиоцитах
На рисунке 2 приведены изменения концентрации Са2+ в цитозоле (слева) и изменения МП митохондрий (справа) в четырех кардиомиоцитах, находящихся в поле зрения конфокального микроскопа. Слева показано, ФА вызывает небольшое повышение базального уровня Са2+ в цитозоле, которое сопровождается появлением Са2+ волн (см. рис 3), распространяющихся по поверхности саркоплазматического ретикулума (либо увеличение амплитуды волн и скорости их распространения). В отдельных клетках концентрация Са2+ быстро и значительно возрастает. На рис. 2В показано, что ФА вызывает медленный рост МП МХ. Добавление разобщителя FCCP вызывает падение флуоресценции TMRM, обусловленное падением МП МХ. Вероятно, повышение концентрации Са2+ в цитозоле и его транспорт в МХ ингибирует протонную АТР-азу и это является причиной роста МП.
Изменение [Ca2+]i и мембранного потенциала клеток эндотелия аорты крысы в ответ на добавление ФА.
Рис3. Изменение [Ca2+]i и мембранного потенциала клеток эндотелия аорты крысы в ответ на добавление 10 мМ ФА
ФА в мМ концентрациях вызывает медленное падение МП МХ (1) и рост концентрации Са2+ в цитозоле (2). При увеличении концентрации ФА часто исчезает лаг-фаза в кинетике повышения Са2+.
Рис 4. Изменение [Са2+]i (А) и МП митохондрий (В) в пяти клетках эндотелия аорты. (С) – Усредненные кривые изменений по пяти клеткам.
ФА вызывает рост [Са2+]i (А) и падение МП митохондрий (В) в клетках эндотелия. Приведены изменения флуоресценции пяти клеток в поле зрения микроскопа. Показано, что ФА также как на кардиомиоцитах вызывает медленный рост Са2+ в течение 15 мин, который, по крайней мере частично, обратим. Изменения МП МХ в среднем обратимы. В отличие от кардиомиоцита, повышение Са2+ в цитозоле сопровождается падением МП МХ, а не ростом.
Действие 20 мМ ФА на Са2+ и МП митохондрий в клетках эндотелия в присутствии DNPG.
Рис 5. Изменение концентрации Са2+ в цитозоле (А) и МП МХ (В) в клетках эндотелия при действии 20 мМ ФА в присутствии 0,4% DNPG. Приведены изменения флуоресценции пяти клеток в поле зрения микроскопа.
Рис 6 С1, С2 Совмещенные кривые изменения концентрации Са2+ в цитозоле и МП МХ в двух клетках эндотелия при действии 20 мМ ФА в присутствии 0,4% DNPG.
На рисунке 6 показано изменение концентрации Са2+ в цитозоле (А) и МП МХ (В) в клетках эндотелия при действии 20 мМ ФА в присутствии 0,4% DNPG. На рис (С1 и С2) приведены совмещенные кривые изменения этих параметров двух клеток. Из рисунков седует, что DNPG не меняет уровня Са2+ в цитозоле, однако вызывает некоторый рост МП МХ. Последующее добавление 20 мМ ФА вызывает временный рост [Са2+]i и по сути возвращение МП МХ к исходному уровню. Причем падение МП в присутствии DNPG значительно меньше, чем в его отсутствии. Таким образом, можно говорить о проявлении защитных свойств DNPG к действию ФА на МП МХ. В канале измерения МП наблюдается некий артефакт добавления DNPG. Причины тушения флуоресценции в момент добавки DNPG нами не исследовались.
Вывод: Таким образом милимолярные концентрации ФА вызывают повышение уровня Са2+ в цитозоле кардиомиоцитов и клеток эндотелия сосудов. Эти изменения невелики, но усиливают функциональную активность кардиомиоцитов. На клетках эндотелия ввиду обратимости повышение Са2+ может иметь сигнальную природу. Повышение концентрации Са2+ в кардиомиоцитах сопровождается ростом МП МХ, а в клетках эндотелия падением МП МХ, что согласуется с литературными данными и нашими предыдущими исследованиями об особой чувствительности системы окислительного фосфорилирования МХ сердца и мозга к ионам Са2+.