Полный текст:
The G protein?coupled receptors (GPCRs) are a large family of integral membrane proteins that are involved in cellular signal transduction. GPCRs respond to a variety of extracellular signals, including neurotransmitters, hormones, odorants and light, and are capable of transducing signals so as to initiate a second messenger response within the cell. Many therapeutic drugs target GPCRs because those receptors mediate a wide variety of physiological responses, including inflammation, vasodilation, heart rate, bronchodilation, endocrine secretion and peristalsis.
GPCRs are characterized by extracellular domains, seven transmembrane domains and intracellular domains. Some of the functions the receptors perform, such as binding ligands and interacting with G proteins, are related to the presence of certain amino acids in critical positions. For example, a variety of studies have shown that differences in amino acid sequence in GPCRs account for differences in affinity to either a natural ligand or a small molecule agonist or antagonist. In other words, minor differences in sequence can account for different binding affinities and activities. (See, for example, Meng et al., J Bio Chem (1996) 271(50):32016?20). In particular, studies have shown that amino acid sequence differences in the third intracellular domain can result in different activities. Myburgh et al. found that alanine 261 of intracellular loop 3 of gonadotropin releasing hormone receptor is crucial for G protein coupling and receptor internalization (Biochem J (1998) 33l(Part 3):893?6). Wonerow et al. studied the thyrotropin receptor and demonstrated that deletions in the third intracellular loop resulted in constitutive receptor activity (J Bio Chem (1998)273(14):7900?5).
Traditional study of receptors has proceeded from the assumption that the endogenous ligand first be identified before discovery could move forward to identify antagonists and other receptor effector molecules. Even where antagonists might have been discovered first, the dogmatic response was to identify the endogenous ligand (WO 00/22131). However, as the active state is the most useful for assay screening purposes, obtaining such constitutive receptors, especially GPCRs, would allow for the facile isolation of agonists, partial, agonists, inverse agonists and antagonists in the absence of information concerning endogenous ligands. Moreover, in diseases that result from disorders of receptor activity, drugs that cause inhibition of constitutive activity, or more specifically, reduce the effective activated receptor concentration, could be discovered more readily by assays using receptors in the autonomous active state. For example, as receptors that may be transfected into patients to treat disease, the activity of such receptors may be fine-tuned with inverse agonists discovered by such assays.
Diseases such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and rheumatoid arthritis (RA) generally are considered to have an inflammatory etiology involving T helper cells, monocyte?macrophages and eosinophils. Current anti?inflammatory therapy with corticosteroids is effective in asthma but is associated with metabolic and endocrine side effects. The same is possibly true for inhaled formulations that can be absorbed through lung or nasal mucosa. Satisfactory oral therapies for RA or COPD currently are lacking.
Рецепторы сопряженные с G-белком (GPCR) представляют собой большое семейство интегрированных мембранных белков, участвующих в клеточной передаче сигнала. GPCR реагируют на различные внеклеточные сигналы, включающие нейромедиаторы, гормоны, пахучие вещества и свет, и способны преобразовывать сигнал для инициации вторичного посредника внутриклеточного ответа. Многие терапевтические средства нацелены на GPCR поскольку эти рецепторы опосредуют широкий спектр физиологических реакций, включая воспаление, расширение сосудов, частоту сердечных сокращений, расширение бронхов, эндокринную секрецию и перистальтику.
GPCR представлены внеклеточными доменами, семью трансмембранными и одним внутриклеточным доменом. Некоторые функции, осуществляемые рецепторами, такие как связывание лигандов и взаимодействие с G-белком, обусловлены присутствием определенных аминокислот на конкретных позициях. Например, ряд исследований показал, что различия аминокислотной последовательности в GPCR обуславливают различия в сродстве как к природным лигандам так и низкомолекулярным агонистам и антагонистам. Другими словами, незначительные различия в аминокислотной последовательности могут приводить к различному аффинитету и активности. (См., например, Meng et al., J Bio Chem (1996) 271(50):32016?20). В частности, исследования показали, что различия аминокислотной последовательности в третьем внутриклеточном домене могут приводить к различной активности. Майбург (Myburgh) с коллегами обнаружили что аланин на 261 позиции внутриклеточной петли и 3-ей позиции гонадолиберинового рецептора является решающим в связывании G-белка и интернализации рецептора (Biochem J (1998) 33l(Part 3):893?6). Вонероу (Wonerow) и др. изучили тиротропиновый рецептор и показали, что удаления в третьей внутриклеточной петле приводят к конститутивной рецепторной активности (J Bio Chem (1998)273(14):7900?5).
Традиционные исследования рецепторов проводились исходя из предположения, что эндогенный лиганд определялся первым, до того как в ходе дальнейшего исследования идентифицировались антагонисты и другие рецепторные молекулы-эффекторы. Даже когда антагонисты могли быть открыты сначала, типичным подходом была идентификация эндогенных лигандов (WO 00/22131). Однако поскольку активное состояние наиболее полезно для целей скрининг-анализа, получение таких конститутивных рецепторов, особенно GPCR, позволит легко изолировать агонисты, частичных агонистов, обратных агонистов и антагонистов в отсутствии информации, относящейся к эндогенным лигандам. Более того, при заболеваниях, вызванных нарушением рецепторной активности, лекарства вызывающие угнетение конститутивной активности, или более специфично понижающие эффективную концентрацию активных рецепторов, могли быть обнаружена легче при исследованиях, использующих рецепторы в автономном состоянии. Например, рецепторы, которые могут быть трансфицированны в пациента в лечебных целях, активность таких рецепторов может быть точно отрегулирована с использованием обратных агонистов, обнаруженных в этих испытаниях.
Болезни, такие как астма, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD) и ревматоидный артрит (RA), предположительно имеют воспалительную этиологию, вовлекающую лимфоциты Т-хелперы, моноциты, макрофаги и эозинофилы. Современная противовоспалительная терапия с использованием кортикостероидов эффективна в отношении астмы, но сопровождается метаболическими и эндокринными побочными эффектами. Тоже самое возможно и для ингаляционных лекарственных форм, которые могут быть легко абсорбированы через легкие или назальную слизь. Удовлетворительные пероральные методы лечения RA и COPD в настоящее время отсутствуют.